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;项目二 多肽类药物的原料制备与质量检验;蛋白质混合物的分离纯化方法
(以溶解度为依据)
;学习内容:
(1)等电点沉淀和pH控制
(2)盐溶和盐析
(3)低温有机溶剂沉淀法
(4)温度对蛋白质溶解度的影响
学习重点:
(1)等电点沉淀和pH控制
(2)盐溶和盐析;实践中最常用
希望要的蛋白质溶解度尽量小
影响蛋白质溶解度有哪些因素?;外界因素:
(1)溶液的pH;
(2)离子强度(缓冲液buffer solution);
(3)溶剂的介电常数(与极性polarity成正比);
(4)温度 (temperature)。;决定因素:蛋白质本身的分子结构 (molecular structure)
;根据蛋白质分子结构(molecular structure)特点,适当改变外界因素,选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度
;1. 等电点沉淀和pH控制(如:血清蛋白提取、酪蛋白提取)
原理:
蛋白质处于等电点pH,净电荷为零,相邻蛋白质分子间没有静电斥力,彼此结聚沉淀,溶解度达到最低点;
不同蛋白质具有不同等电点,可把蛋白质混合物彼此分开。;前提:要提取的蛋白质在等电点附近不变性
操作:蛋白质混合物的pH调到其中一种的等电点pH,这种蛋白质被沉淀,其它蛋白质仍留在溶液中,依次分离蛋白质组分
如:不同组分酪蛋白的分离(根据不同酪蛋白在不同浓度尿素溶液中的溶解性差异,再利用等电点进行沉淀)
;pH调节你会了吗?
职业素养:耐心、细心,不要“不拘小节”;优点:
蛋白质仍保持天然构象,能重新溶解
缺点:
单纯使用效果不好,需与其他方法(如盐析法、有机溶剂沉淀法等)配合使用
应用:
猪血清蛋白的提取(pH4.5、7.4),牛奶中酪蛋白的提取(pH4.7),不同组分酪蛋白的分离(多个pH);2. 盐溶和盐析(如:血清蛋白提取)
原理:
低浓度中性盐增加蛋白溶解度,盐溶(salting in)
离子强度增加到足够高时(饱和或半饱和),蛋白质从溶液中沉淀出来,盐析(salting out);优点:
蛋白质一般不变性,是最常用的蛋白质沉淀方法
分级沉淀:不同性质(水化层大小、净电荷情况)的蛋白质可通过加入不同浓度的中性盐而分别从溶液中沉淀出来
;应用:
硫酸铵分级盐析:在人和各种动物血清蛋白???分离纯化中得到了广泛的应用;
硫酸镁盐析:分离提纯并结晶牛胰脏中水解蛋白质的酶原和酶。;3. 低温有机溶剂沉淀法(如:酪蛋白提取)
原理:
与水互溶的有机溶剂使蛋白质在水中的溶解度显著降低(如尿素:酪蛋白悬浮于尿素中);
引起不同蛋白质沉淀的有机溶剂浓度不同,因此,可分级沉淀蛋白质(类比盐析);
乙醇和丙酮最常用。;优点:沉淀蛋白质的选择性较高,且不需脱盐(尿素除外)
缺点:温度高可引起蛋白质变性denaturation,故应低温操作
应用:卵清蛋白的分离;4. 温度对蛋白质溶解度的影响
大多数蛋白质在低温下比较稳定,一般在0℃或更低温度下进行
;方法:调节pH使溶液从中性渐变成酸性,同时控制乙醇浓度和离子强度,扩大各种蛋白质溶解度的差别,使不同的蛋白质先后沉淀出来
;总结:蛋白质混合物的分离纯化方法(以溶解度为依据)
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