生物制药与药品检验技术 寻找最适合的“水晶鞋”--蛋白质混合物的分离纯化方法1 课件：蛋白质混合物分离纯化的方法（以溶解度为依据）.pptx

;项目二 多肽类药物的原料制备与质量检验;蛋白质混合物的分离纯化方法 （以溶解度为依据） ;学习内容： （1）等电点沉淀和pH控制 （2）盐溶和盐析 （3）低温有机溶剂沉淀法 （4）温度对蛋白质溶解度的影响 学习重点： （1）等电点沉淀和pH控制 （2）盐溶和盐析;实践中最常用 希望要的蛋白质溶解度尽量小 影响蛋白质溶解度有哪些因素？;外界因素： （1）溶液的pH； （2）离子强度（缓冲液buffer solution）； （3）溶剂的介电常数（与极性polarity成正比）； （4）温度 （temperature）。;决定因素：蛋白质本身的分子结构 （molecular structure） ;根据蛋白质分子结构（molecular structure）特点，适当改变外界因素，选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度 ;1. 等电点沉淀和pH控制（如：血清蛋白提取、酪蛋白提取） 原理： 蛋白质处于等电点pH，净电荷为零，相邻蛋白质分子间没有静电斥力，彼此结聚沉淀，溶解度达到最低点； 不同蛋白质具有不同等电点，可把蛋白质混合物彼此分开。;前提：要提取的蛋白质在等电点附近不变性 操作：蛋白质混合物的pH调到其中一种的等电点pH，这种蛋白质被沉淀，其它蛋白质仍留在溶液中，依次分离蛋白质组分 如：不同组分酪蛋白的分离（根据不同酪蛋白在不同浓度尿素溶液中的溶解性差异，再利用等电点进行沉淀） ;pH调节你会了吗？ 职业素养：耐心、细心，不要“不拘小节”;优点： 蛋白质仍保持天然构象，能重新溶解 缺点： 单纯使用效果不好，需与其他方法（如盐析法、有机溶剂沉淀法等）配合使用 应用： 猪血清蛋白的提取（pH4.5、7.4），牛奶中酪蛋白的提取（pH4.7），不同组分酪蛋白的分离（多个pH）;2. 盐溶和盐析（如：血清蛋白提取） 原理： 低浓度中性盐增加蛋白溶解度，盐溶（salting in） 离子强度增加到足够高时（饱和或半饱和），蛋白质从溶液中沉淀出来，盐析（salting out）;优点： 蛋白质一般不变性，是最常用的蛋白质沉淀方法 分级沉淀：不同性质（水化层大小、净电荷情况）的蛋白质可通过加入不同浓度的中性盐而分别从溶液中沉淀出来 ;应用： 硫酸铵分级盐析：在人和各种动物血清蛋白???分离纯化中得到了广泛的应用； 硫酸镁盐析：分离提纯并结晶牛胰脏中水解蛋白质的酶原和酶。;3. 低温有机溶剂沉淀法（如：酪蛋白提取） 原理： 与水互溶的有机溶剂使蛋白质在水中的溶解度显著降低（如尿素：酪蛋白悬浮于尿素中）； 引起不同蛋白质沉淀的有机溶剂浓度不同，因此，可分级沉淀蛋白质（类比盐析）； 乙醇和丙酮最常用。;优点：沉淀蛋白质的选择性较高，且不需脱盐（尿素除外） 缺点：温度高可引起蛋白质变性denaturation，故应低温操作 应用：卵清蛋白的分离;4. 温度对蛋白质溶解度的影响 大多数蛋白质在低温下比较稳定，一般在0℃或更低温度下进行 ;方法：调节pH使溶液从中性渐变成酸性，同时控制乙醇浓度和离子强度，扩大各种蛋白质溶解度的差别，使不同的蛋白质先后沉淀出来 ;总结：蛋白质混合物的分离纯化方法（以溶解度为依据）