维生素A和维生素E的测定方法.docx

维生素A和维生素E的测定方法（HPLC ） 杨月欣教授等 高效液相色谱法 最小检出量分别为 VA : 0.8ng； aE : 91.8ng； yE： 36.6ng； 8-E : 20.6ng。 原理 食物中的维生素 A及维生素E经皂化提取以后，将其不可皂化的部分提取到有机溶剂中。 用HPLC法 测定维生素A及维生素E的含量。 适用范围 GB12388-90本法适用于各种食物和饲料的测定 3.仪器 (1) 高压液相色谱仪（带紫外检测器） (2) 六孔恒温水浴锅 (3) 旋转蒸发器 (4) 高纯氮气 (5) 高速离心机 4.试剂 本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水 4.1无水乙醇：重蒸，不含有醛类物质 检查方法：取2ml银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入 10%氢氧化钠溶液，加热，放置 冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。 脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中。 取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。 将两者倾入1L乙醇中，振摇后， 放置暗处两天（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶蒸馏，弃去初蒸岀的 50ml。当乙醇中： 10%抗坏血酸溶液（Vc） W/V临用前配制 50%氢氧化钾溶液（KOH） W/V 4.4无水乙醚 重蒸，不含过氧化物 4.4.1过氧化物检查方法：用 5ml乙醚加1ml10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水 层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。 4.4.2去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放入铁丝或铁末少许。弃去 10%初馏液和10%残馏液。 pH 1-14 试纸 无水硫酸钠 Na2SO4 4.7甲醇色谱纯或分析纯重蒸后使用 4.8重蒸水蒸馏水中加入少量高锰酸钾重蒸后使用 4.9苯并〔e〕芘标准液 称取苯并〔点〕芘（纯度98%），用脱醛乙醇配制成 1ml相当于5川苯并〔e〕芘 的内标溶液。 4.10维生素A标准液视黄醇（纯度85% Sigma公司）用脱醛乙醇溶解维生素 A标准品，使其浓度大约为 1ml相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。 维生素E标准液a生育酚（纯度95% Sigma公司），8-生育酚（纯度95% Sigma公司），8-生育酚（纯度95% Sigma公司）。用脱醛乙醇分 别溶解以上三种维生素 E标准品，使其浓度大约为 1ml相当于1mg。临用前用紫外分光光度法分别标定此 三种维生素E的准确浓度。 操作步骤 本实验需避光操作 （1） 样品皂化称取样品于三角瓶中，加 30ml无水乙醇，振摇三角瓶，使样品分散均匀。加入 5ml 10%抗 坏血酸和苯并〔e〕芘标准液2ml，混匀。最后加入10ml氢氧化钾边加边振摇。于沸水浴上回流 30min使 样品皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。 （2） 样品萃取将皂化后的样品移入分液漏斗中，用 50ml水分2次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用 10 0ml无水乙醚分两次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇分液漏斗 2min，静置分层，弃去 水层。然后每次用约100ml水将乙醚液洗至中性，约 4-5次。 （3） 浓缩将乙醚提取液经无水硫酸钠（约 5g）滤入150ml旋转蒸发瓶内，用约 15ml乙醚冲洗分液漏斗及 无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发器上，于 55C水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中 乙醚剩下约2ml时，取下蒸发瓶，立即用氮气将乙醚吹干。加入 2ml乙醇溶液，充分混合，溶解提取物。 将乙醇液移入塑料离心管中，于离心机上以 3000转/min离心5分钟。上清液供色谱分析。 （4） 标准曲线的制备 将维生素A和维生素E标准品配置成标准溶液（约 1mg/ml），制备标准曲线前用紫 外分光光度法标定其准确浓度。标准浓度的标定方法 取维生素A和维生素E标准液若干微升，分别稀释 至10.00ml乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算该维生素的浓度。测定 条件如下 标准 比吸光系数E1%cm 波长人nm 视黄醇 1835 325 a—生育酚 71 294 Y—生育酚S— Y—生育酚 S—生育酚 浓度计算： 92.8 91.2 298 298 X仁 A/E XI/100 X0.00/S 10-3 式中X1 :某维生素浓度，mg/ml; A :维生素的平均紫外吸光值； S:加入标准的量，gL; E:某种维生素1%比吸光系数； 10.00/S X0-3 :标准液稀释倍数。 本法采用内标两点法进行定量。把一定量的维生素 A、维生素E及内标苯并〔e〕芘液混合均匀，选择合适 的灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程的 70%，作为高浓度点，高浓度的 1/2为低浓度点(内标苯并 〔e〕芘的浓度值不变)，用此二种浓度的混合标准进行色谱分析。根据微处理机装