生物制品技术 SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电容分离蛋白质 电泳技术.ppt

返回 双脱氧末端终止测序法的基本反应：GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA DNA序列分析法:双脱氧末端终止测序法 聚丙烯酰胺 O CH CH2 NH2 C Acrylamide Acrylamide O CH CH2 NH C O CH CH2 NH C CH2 bis-Acrylamide 聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺（ CH2 =CH-CO-NH2 ）和交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺（ CH2 =CH-CO-NH-CO-CH=CH2 ） 凝 胶 O CH CH2 NH2 C O CH CH2 NH2 C O CH CH2 NH2 C bis-Acrylamide O CH CH2 NH C O CH CH2 NH C CH2 O CH CH2 NH2 C O CH CH2 NH2 C NH2 O CH CH2 C 自由基引发下而形成丙烯酰胺链的交联，从而形成了三维空间的凝胶网络 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶具有一定的网状结构。如果形成的孔径大小接近于所分离样品分子的平均半径，样品分子在通过凝胶孔洞时，所受到的阻力就会和样品分子的大小及形状有关。 H-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-O-S-O-Na+ H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H O O Non-polar Hydrophobic tail Hydrophilic head SDS（C12H25NaO4S） Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基磺酸钠 是一种阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合从而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 SDS Protein SDS and Proteins 蛋白质分子与SDS充分结合后，所带上的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而也就掩盖或消除了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异。 这样的蛋白质-SDS复合物在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率便不再受蛋白质原有电荷和形状等因素的影响，而主要取决于蛋白质分子量大小。 SDS自然电泳与SDS变性电泳 加 样 加电场，样品浓缩在界面上 电泳结束 加 样 加电场，分子开始迁移 电泳结束 连续电泳 不连续电泳 在某一PH下，蛋白质分子在电场中不再移动，即静电荷为零，则此PH值即为该蛋白质的等电点。 5、等电聚焦： PI2 PI3 PI1 + + - + + + - - + - - - PH增加 + _ 蛋白质 1 2 3 蛋白质在电场中，等点聚焦示意图 优点： ①分辨率很高； ②样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用。 ③电泳结束后，可直接测定蛋白质pI。 ④分离速度快，蛋白质可保持原有生物活性。 缺点： ①电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀，可在样品中多加些两性电解质。 ②许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决。 6、毛细管电泳 第二向根据蛋白质的分子量大小不同在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS) 7、双向电泳 第一向根据蛋白质的等电点不同在PH梯度胶中等点聚焦（isoelectric focusing,IEF) 蛋白质双向电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法、免疫染色法以及蛋白质印迹法。 染 色 2-DE Comparison of Proteins from two different conditions 8、蛋白质印迹 蛋白质印迹方法将高分辨率的电泳技术与灵敏的、专一的免疫探测技术结合起来,用针对蛋白特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针进行检测.对于蛋白质,通常使用的探针是抗体,它与附着于固定基质上的靶蛋白发生特异性反应. Western blotting原理图示 9、免疫电泳 1、抗原抗体特异性反应。 2、抗原在PH8.6时通常带强负电，而抗体不带电。 3、抗原在含有抗体的凝胶中电泳时发生免疫反应，抗原过量，仅产生可溶性的免疫复合物与抗原一起向阳极移动。 4、抗原与抗体浓度达到当量点时，形成免疫沉淀带。 免疫电泳(immunoelectrophoresis，IEP)是将区带电泳与双向免疫扩散相结合的一种免疫化学分析技术。先将蛋白质抗原在琼脂平