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;项目一 血清蛋白类药物的原料制备与分析检验;实训 猪血中血清蛋白的提取;一、实训目的;二、实训意义;三、实训准备;试剂:
1. 饱和硫酸铵溶液
等电点促进蛋白质沉淀,选择4.5(白蛋白)和7.4(IgG)两个pH值进行盐析。
(1)饱和硫酸铵(SAS)A(1L):量取 500ml 水,加热至80℃。称取硫酸铵 400g 溶于水中,搅拌 20min,冷却后上清即为饱和硫酸铵。再取28% 氨水调 pH值至 7.4。
(2)饱和硫酸铵(SAS)B (1L) :取0.5mol/L H2SO4 调 pH值至 4.5。;2. 缓冲液
(1)缓冲液A(500mL):称取NaCl 76.5g、柠檬酸·H2O 1.92g、Na2HPO4·12 H2O 32.54g,溶于水,调pH值为7.4,定容于1000ml。
(2)缓冲液B (500mL) :称取NaCl 76.5g、柠檬酸·H2O11.52g、Na2HPO4·12 H2O 16.18g,溶于水,调pH值为4.5,定容于1000ml。
3. 其他溶液
0.85% NaCl 溶液 (2L);思考题:
1、为什么在血清中加入硫酸铵,蛋白质就沉淀了?
2、为何选取这2个pH值(4.5,7.4)(pH value)进行盐析?
3、缓冲液(buffer solution)的作用?
4、式(1) 5 mL缓冲液+10S×5 mL SAS+(8-10S)×5 mL水 理解了吗?
5、冰箱静置过夜目的?
6、为何用不同饱和度的硫酸铵进行盐析?
饱和度—盐浓度(concentration);四、实训步骤;步骤一:猪血清准备
取新鲜采集的猪血,离心(centrifuge),取上层血清(upper serum)。
;步骤二:分级盐析提取猪血清蛋白
按照式(1)配制底液,混匀后加入5 mL血清,轻轻振荡混匀,4℃冷藏过夜。
5 mL缓冲液+10S×5 mL SAS+(8-10S)×5 mL水(1)
S为硫酸铵饱和度。样品为10倍稀释血清样品。
在pH7.4或pH4.5条件下进行分级盐析。
注意观察:硫酸铵饱和度增加,沉淀增多了?(如图);步骤三:离心(centrifuge )(至少24h后)
取15 mL样品(sample)离心10 min,转速4000r/min。
沉淀溶于25 mL 0.85% NaCl 溶液(solution)中(50 mL容量瓶)。
上清液(supernatant)弃去。
;步骤四: 脱盐(desalination)
目的:除去硫酸铵等
不是必须的步骤;步骤五:冰箱保存样品,供下次使用。
;五、注意事项;六、安全提示;七、实训小结
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