比较蛋白质组学及系统的研究的方法.ppt

比较蛋白质组学及系统研究方法  第一部分:基本概念 蛋白质的合成受时空等多种因素调控,在不同的组织细胞 中蛋白质合成及表达的种类和数量有很大的差异,即使在 细胞发育的不同阶段,因不同时期、不同条件,蛋白质组 的构成也在不断的变化,是动态的过程 Genome→ Transcriptome→ Proteome CGTCCAACIGACS DNA sequencing cDNA arrays D 较蛋白质组学及系统研究方法  第一部分:基本概念 蛋白质组( Proteome)指由一个基因组,或一个细胞、组织表 达的所有蛋白质。 比较蛋白质组学:蛋白质组间差异蛋白的研究 较蛋白质组学及系统研究方法  第一部分:基本概念 比较蛋白质组学基本技术路线 物物 实验组和对照 组样品的制备 捆 白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析 胰酶对脱色后蛋白质消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 其它实验 蛋白质的发 较蛋白质组学及系统研究方法  第二部分:比较蛋白质组学系统研究方法 蛋白质的提取 蛋白质的分离 3蛋白质样品的分析 4验证 较蛋白质组学及系统研究方法  第二部分:比较蛋白质组学系统研究方法 蛋白质的提取 样品制备对于获得可靠、准确的2D电泳结果至关重要 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态(包括多数疏水性蛋 白),且制备方法应具有可重现性 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰(如酶性或化 学性降解等) 粘液层 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白 英膜层 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白 的可检测性 样品的分级处理 可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。 当前最简单有效的处理是采用分级抽提,按 样品溶解度不同进行分离。 较蛋白质组学及系统研究方法  第二部分:比较蛋白质组学系统研究方法 增加样品溶解性的手段 变性剂:通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展,将其疏水中心 完全暴露,降低接近疏水残基的能量堿。其典型代表是尿素和硫尿 表面活性剂:经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后,还常需至少 种表面活性剂来溶解疏水基团 还原剂:在变性剂和表面活性剂联用条件下,加用还原剂可使已变性的 蛋白质展开更完全,溶解更彻底 denatured 较蛋白质组学及系统研究方法  第二部分:比较蛋白质组学系统研究方法 硫转运膜蛋白质的有效分离和提取 水浴加热处理 TritonⅩ-114相分离法提取膜蛋白 蛋白质沉淀及透析除杂 真空冷冻干燥 较蛋白质组学及系统研究方法  第二部分:比较蛋白质组学系统研究方法 双向电泳分离膜蛋白 垂直胶管中进 行等电聚焦 SDS丙烯酰胺凝胶电泳 urea,N-40胶在SDs缓 非连续梯度胶 冲液中平衡 按等电点分离(电荷) 按分子量分离(质量) Principle according to p H. o Farre/1 and Klose(1975) 较蛋白质组学及系统研究方法  第二部分:比较蛋白质组学系统研究方法 双向电泳具体步骤 蛋白预处理(裂解,水化) 蛋白质上样缓冲液的配制:一定量 的蛋白质样品溶解在缓冲液含 moI/L尿素,2mol/L硫脲 4%o CHAPS, 1%o NP-40 2%IPG缓冲液,65mmol/L DTT,0.002%溴酚蓝 IPG条重泡涨及上样 第一向:工EF IPG条平衡 平衡缓冲液Ⅰ(还原) 平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化) 第二向:SDs 胶条染色及脱色 凝胶成像及图像分析 较蛋白质组学及系统研究方法