基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术.pptxVIP

博士专题：基因功能研究技术之  ——基因敲除、基因编辑技术;II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失;;基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。;基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制： 有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。 ;（二）条件型基因敲除;Cre-LoxP重组酶系统 ;Cre-LoxP重组酶系统 ;Cre-LoxP重组酶系统 ;;;;; Cre/loxP系统作用原理示意图;FLP／FRT 系统;这一技术亦存在一些缺点： 费用太高 周期较长 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这些基因的功能为其他基因代偿所致;（三）诱导型基因敲除;由Cre/Loxp系统和诱导系统两个部分组成。Loxp转基因动物是用常规基因打靶技术构建成的，基因组中待修饰区域两端各携带1个Loxp位点的转基因动物。诱导系统是指所携带的Cre基因的表达或所表达的Cre的酶活性具有可诱导性的转基因动物。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计来对动物基因敲除的时空特异性进行人为控制，以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。 常见的几种诱导型基因敲除类型有：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。;III、基因编辑技术;（一）ZFN技术系统;ZFN 技术原理;;ZFN 技术;;（二）;崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改 （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除，Knockout） 片段删除 片段插入 目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗 ;靶向基因技术;TALEN技术;1989年 植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。 2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 – TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译 由34个aa组成一个单元模块，重复17 -18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 对应识别一个目标碱基;人工构建TALE模块识别指定核酸序列;;TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对 ;TALEN介导的同源重组;2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》 《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》 一篇综述 《Move over ZFN》 ;TALEN靶向（基因敲除）技术基本流程;; TAL的核酸识别单元为34aa模块中的双连氨基酸（RVD） RVD与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G，非常简单明确 欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元（14 -18个）串联克隆即可。;;;步骤二：TALEN表达质粒构建;将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（14 - 18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。 ;步骤三. 将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除