曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、总酚含量和丙二醛含量的测定方法.doc

曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中关于多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、总酚含量和丙二醛含量的测定方法 1.多酚氧化酶（PPO）提取及活力测定 1.1基本原理： 多酚氧化酶（PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或采后的贮藏加工过程中，果蔬出现褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。 多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化物形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。因此，可以用比色法测定多酚氧化酶的活性。 1.2实验试剂和仪器： a.仪器及用具：研钵、高速冷冻离心机、分光光度仪、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000mL） b．试剂 1）0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液 母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。 母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。 取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。 2）提取缓冲液（含1mmol PEG、4% PVPP和1% Triton X-100） 称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4%PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，polyvinyl-polypyrrolidone），取1mL Triton X-100，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。 3）50mmol/L邻苯二酚溶液 取275mg邻苯二酚，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至50mL。 1.3实验步骤 1）酶液制备 称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。 2）活性测定 取一支试管，加入4.0mL 50mmol/L、pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液（2.0mL 0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液加蒸馏水稀释4.0mL）和1.0mL 50mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100μL酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长420nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。 1.4数据处理： 记录反应体系在420nm处的吸光值，制作OD420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分（从时间I到时间F）计算每分钟吸光度值变化??OD420。 ??OD420=O 式中 ??OD420——每分钟反应混合液吸光度变化值； OD420F——反应混合液吸光度终止值； OD420I——反应混合液吸光度初始值； tF——反应终止时间，min； tI——反应初始时间，min。 以每克果蔬样品（鲜重）每分钟吸光度变化值增加1为1个活性单位，单位是??OD420/min·g。计算公式： U= 式中 V——样品提取液总体积，mL； VS——测定时所取样品提取液体积，mL； m——样品质量，g。 1）测定数据记录 重复次数 样品质量m/g 提取液体积V/mL 吸取样品液体积VS/mL 420nm处吸光度值 样品中过氧化物酶活性/（ΔOD420/min·g） OD0 OD1 OD2 OD3 OD4 OD5 ΔOD 计算值 平均值±标准偏差 1 2 3 2.过氧化物酶（POD）提取及活力测定 2.1实验试剂和仪器 a．仪器及用具 研钵、高速冷冻离心机、分光光度仪、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（50mL、100mL 、1000mL）。 b．试剂 1）0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液 母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。 母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。 取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。 2）提取缓冲液（含1mmol PEG、4% PVPP和1% Triton X-100） 称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4%PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，polyvinyl-polypyrrolidone），取1mL Triton X-100，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。 3）25mmol