2020碱裂解法抽提大肠杆菌质粒.ppt

实验一 碱裂解法抽提大肠 杆菌质粒 1 、实验目的 ： 学习与掌握碱裂解法抽提大肠杆菌质 粒 DNA 的原理与方法 2 、实验原理： 碱裂解法抽提质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与 质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离的目的。 3 、实验步骤及各步注意事项 1. 取 1.4ml 大肠杆菌培养液 12000rpm 离心 2min ，弃上清，收集菌体。 注意点：上清为培养基，必须尽量倾倒 干净，并在吸水纸上吸干，如有较多培 养基残留可能会影响后续实验。 2. 加 100μ l 的溶液 I ，使菌体充分悬浮，室 温静置 3min 。 注意点：必须充分混匀至看不见沉淀， 可用移液器吹打或者用混匀器振荡。 3. 加入 200μ l 溶液 II ，温和上下颠倒 2-3 次， 溶液转变为澄清透明。 注意点：不可剧烈振荡。 4. 加入 150μ l 溶液 III ，上下颠倒混匀数次， 静置 2-3min 。 注意点：不可剧烈振荡，此时应出现白 色沉淀。 5. 12000 rpm 离心 5min 。 6. 取上清，加等体积（ 400μ l ）的酚 / 氯仿 / 异戊醇，充分混匀，室温， 12000rpm 离 心 5min 。 注意点：酚氯仿有腐蚀性，盖严离心管 盖，避免接触酚氯仿，如接触立即用水 冲洗。 7. 吸上层水相，再加 1ml( 约 2.5 倍体积）预 冷的无水乙醇，混匀。 注意点：一定避免吸到中间沉淀及下层 酚氯仿。宁可损失一定上清。