SDS-PAGE具体步骤（精品完整版）.docxVIP

（一）安装夹心式垂直版电泳槽 各部分依下顺序安装： 装上储槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上； 将长、短玻璃板分别插到硅胶框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面，以保持玻璃清 洁； 将已插好玻璃板的凝胶模平方在储槽上，短玻璃板应面对上储槽； 将下储槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上储槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。竖 直电泳槽，用细头长滴管吸取已熔化的 1% 琼脂（糖）溶液，封住长玻璃板下端与硅胶膜间 的缝隙。加琼脂（糖）溶液时，应防止气泡进入。琼脂（糖）溶液用不连续体系电极缓冲液 配制。 （二）配胶及凝胶板的配制 1、配胶 配胶应根据所测蛋白质相对分子质量范围选择适宜的分离胶浓度。 2、凝胶板的配制 分离胶的制备： 按表配制20mL10%的聚丙烯酰胺（PAA）溶液，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至 长、短玻璃板之间的缝隙内，约 8cm 高，用 1mL 注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板壁缓慢 注入，约 3~4mm 高，以进行水封。 30min 后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则 表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。 浓缩胶的制备： 按表配制10mL3%的PAA，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方， 直至距离玻璃板上缘约 0.5cm 处轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内， 约 30min 后凝胶聚合， 再 放置20~30min，使凝胶老化”。小心拔去样品槽模板，将 pH值为8.3的Tris-甘氨酸缓冲 液倒入上、下储槽中，应没过短玻璃板 0.5cm 以上，即可准备加样。 （电极缓冲液即 pH 值为 8.3 的 Tris- 甘氨酸缓冲液，内含 0.1%的 SDS） （三）样品的处理与加样 样品的处理： 称取0.5~1mg蛋白质加1mL样品溶解液处理，溶解后，在 100摄氏度沸水浴中保 温3min,取出冷却后取样电泳。（如处理好的样品暂时不用， 可放在-20摄氏度冰箱内保存， 使用前在100摄氏度沸水中加热 3min，以除去亚稳态聚合物。） 加样： （加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为 10~15uL（ 即 2~10ug蛋白）；如样品较稀，加样体积可达 100uL。如样品槽中有气泡，可用注射器针头跳 出。）加样时，将微量注射器的针头穿过电极缓冲液深入加样槽内，应尽量接近底部，轻轻 推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。 （由于样品溶解液中含有相对密度较大的蔗 糖或甘油，因此，样品溶液会自动沉降在凝胶表面而形成样品层。 ） （四）电泳 （ 分离胶聚合后是否进行预电泳，这应根据需要而定。 ） 在电极槽中倒入 pH值为8.3的Tris-HCI电极缓冲液（内含0.1%的SDS）即可进行 电泳。在制备浓缩胶后，不能进行预电泳，因预电泳会破坏胶中的 pH 值环境，预电泳只能 在分离胶聚合后进行， 应采用分离胶缓冲液。 预电泳后， 将分离胶面冲洗干净， 然后才能制 备浓缩胶。电泳条件也不同于连续系统，开始时电流为 10mA 左右；待样品进入分离胶后， 改为20~30mA ;当燃料前沿距硅胶框底边 1.5cm时，停止电泳，关闭电源。 （五） 凝胶板的剥离与固定 电泳结束后，取下凝胶膜，卸下硅胶框，用镊子撬开短玻璃板，并切下凝胶板的 一角作为加样标志。 在两侧溴酚蓝染料区带中心， 插入细铜丝作为前沿标记。 将凝胶板放在 大培养皿内，加入固定液，固定过夜。 （六） 染色与脱色 将染色液倒入培养皿中，染色 1h 左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色， 直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。 （七）绘制标准曲线 将大培养皿放在一张坐标纸上，量出溴酚蓝区带中心距加样端的的距离（ cm） 以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（ cm） ，按下式计算相对迁移率（ mR） : 相对迁移率 =蛋白质样品区带中心与加样端的距离（ cm） /溴酚蓝区带中心加样端的距离 （ cm ） ; Mr=K*10-bm; lgMr=lgK -b*m=K1 -b*m Mr 为蛋白质的相对分子质量; K,K1 为常数; b 为斜率; m 为迁移率。 （以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标， 标准蛋白质分子量为纵坐标， 在半对数坐标纸上作 图，可得一条标准曲线。 ） 试剂—— 不连续体系有关试剂： 【100g/L的SDS溶液。称取5gSDS，加双蒸水至50mL ,微热使其溶解，置于试剂瓶内， 于4摄氏度下储存。SDS在低温下易析出晶体，使用前应微热使其完全溶解； 1% （体积分数）的 TEMED溶液。量取1mL TEMED，加双蒸水稀释至 100mL,置于棕色 瓶内，于 4摄氏度下储存； 100g/L的AP溶液。称取1g AP,加双蒸水溶解至10mL，最好临用前配制； 样品溶解液（内含2%的SDS、5%的巯基乙醇、40%的蔗糖、0.