抗氧化实验方法[借鉴].docxVIP

方法整理 | 借鉴参考collection of questions and answers 方法整理 | 借鉴参考 collection of questions and answers 方法汇编 | 精品资料 PAGE 1 借鉴参考 | 实用可编辑 1还原力的测定 样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混合液中。混合物在50℃保温20min，然后在反应混合物中加入2ml 10%的TCA，混合后以3000rpm离心10min，取上清液2ml与2ml蒸馏水以及0.4ml 0.1%氯化铁在反应试管中反应，10min后测定其在700nm处的吸光值。吸光值越大表明还原力越强。 注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变化，例如2.5，5之类变化。但具体情况应根据吸光值大小而定。 0.2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表。 铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中。 比色皿的用法：可见光(400nm)用玻璃比色皿（即没有标字母或者标G的比色皿），紫外光时（400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）。 2 DPPH自由基清除活性的测定 将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混合，振荡，在 室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）。清除率计算公式为： 空白为1.5 ml 95%的乙醇加入1.5 ml蒸馏水调零。 式中：Ac——对照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏水在517nm处的吸光值； Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值； Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值； 注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变化，如0.5,1,2,2.5之类变化，但是具体情况应视清除率而定，最终结果应有清除率大于50%和小于50%的情况。 DPPH样品有毒，需戴口罩和手套进行操作。而且DPPH试剂很昂贵，用时注意节约。 0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml。 3 在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定 以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS缓冲液补足至2.0mL。对照管除不加样液外其他试剂同前。将上述2种试管同时置37℃恒温水浴锅中保温培养1h。取出后，加入20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对照管于3500r/min离心10min，取2.0mL上清液，分别加入质量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，加塞于100℃水浴15min，取出冷却。空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下测定吸光度，样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率表示为: SA(%)=(Ac一AS)/AC×100 式中:Ac一不加样品的吸光度 As一加入样品的吸光度 注意：卵黄溶液不用时应放置冰箱保存。 酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调整，但具体应视清除率大小而定，对酶解液蛋白浓度进行调整。 硫代巴比妥酸溶液需放置于棕色瓶内保存。并以50m mol/L NaOH溶液配制。再在50℃水浴溶解。 FeSO4溶液应以棕色瓶盛装。 4 过氧化值的测定 参照本食品学院林华娟等老师主编的食品分析实验讲义一书。 5 超氧阴离子自由基清除率的测定 邻苯三酚自氧化速率（V对照）：对照组和空白对照组加入4ml 蒸馏水（去离子水）和，0.1 mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.2) 4.5ml，在25℃水浴20min后，样品组加入0.2ml （或0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空白组以相同体积蒸馏水（去离子水）代替。震匀后马上在320nm处测定吸光值。迅速混匀并开始计时，每隔30 s读取吸光值,4 min后结束，以空白对照管调零。作吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V对照。（V对照在0.05A/min~0.065A/min之间，否则应调整邻苯三酚加入量） 样品自氧化速率（V样品）：样品组和空白组均加入一定浓度的样品溶液4ml，0.1 mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.2) 4.5ml，在25℃水浴20min后，样品组加入0.2ml （或0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空白组以相同体积蒸馏水（去离子水）代替。震匀后马上在320nm处测定吸光值。迅速混匀并开始计时，每隔30 s读取吸光值,4 min后结束，以空白管调零。