锐博siRNA产品说明书.pdf

siRNA 使用说明 （2009-08） 名称： 常规化学合成siRNA。 产品简介： 常规化学合成siRNA为21-25nt，带有2nt 的 3端悬垂的双链小RNA（3端悬垂通常为dTdT或者UU，也可以选择其他的碱 基作为3端悬垂）。 产品剂量经过严格测算，以摩尔数标明。产品剂型为冻干粉，即用型的 siRNA 已经经过去保护、退火、纯化等处理，只要 用灭菌的 ddH2O 或者RNase-free water溶解并配制成20μM液体即可直接用于细胞转染及其他实验。 保存和使用： 保存： 液体剂型，siRNA的贮存浓度一般为20μM，-20℃或-70℃保存半年以上； 冻干粉剂型，-20℃或-70℃保存一年以上。开盖前，请先稍稍离心，将粉末收集管底，再用灭菌的 ddH2O 或者RNase-free water，配制成20μM的液体剂型。 例如：20nmolsiRNA冻干粉，需要加入1ml 水溶解（其他剂量可以按照比例计算加水量）。 注意：（1）液体剂型产品，应避免反复冻融（尽量不要超过 5 次），建议溶解后的产品分装保存。（2）如果近期不做实 验，产品需要长期放置，最好以冻干粉形式保存。 使用： 产品使用时（转染过程），siRNA 最好冰上放置，使用完毕，请于-20℃或-70℃小心保存; 整个实验过程，要求无 RNA 酶环境，枪头、EP管都要经 DEPC处理； 特别提示：荧光标记 siRNA 要求避光。 使用方法： 1. siRNA 的转染浓度：推荐的siRNA转染浓度是 50nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围可以是10～150nM。 （siRNA及转染试剂的建议用量，请参照“实验指导”）。 2. 使用 lipofectamine2000（Invitrogen）转染 siRNA 的步骤（仅供参考）： (1) 转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到 30～50％ （不同细胞生长速度不一样， 因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验），请使用无抗生素的培养基。 注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，从而降低细胞的转染效率。而 细胞密度过低则可能达不到生长的要求，也会因此影响转染效率。 (2) 对于每个转染样品，按如下步骤准备 siRNA- lipo2000 混和液（试剂的用量和体积，请参照 “实验指导”）： a. 稀释转染试剂 lipofectamine2000 （以下称lipo2000 ）：使用前，将lipo2000 转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清 的优化培养基（Opti- MEM Ⅰ）稀释，轻轻混和，室温孵育5min； b. 稀释 siRNA：用不含血清的Opti -MEM Ⅰ稀释siRNA，轻轻混和； c. 稀释好的 lipo2000 经过 5min 的孵育后，将之与上述（b ）稀释好的siRNA 轻轻混和，室温培养20min 以形成siRNA-lipo2000 混和物，溶液可能会有浑浊，不过不会影响转染。 注意：稀释好的 lipo2000，如果长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在 30min 之内与稀释好的 siRNA 混和。 (3) 将 siRNA-lipo2000 混和液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混和； (4) 将培养板置于 37 ℃的 CO2 培养箱中培养至检测时间（24～96h ）。沉默效率的检测一般建议的时间为24～72h 。 可选操作（并非必要的操作）：转染操作完成，经过 37℃培养 4～6h 后，可以将孔里含有 siRNA-lipo2000 混合液的培养基 移去，更换新鲜的生长培养基，这样也不会影响转染的效率。 注意：如果转染时使用的是不含血清的培养基（即血清饥饿的条件下进行转染），4～6h 后必须换成完全培养基（含血清、 含抗生素），以确保细胞生长。 3. mRNA 水平的检测：siRNA 的作用机理在于其引起靶 mRNA 的降解，因此 mRNA 的降解水平是 siRNA 沉默效率的最直接指标。 一般在siRNA 转染后24h即可以检测到靶mRNA水平的降低。检测方法一般采用RT-PCR（半定量）或Real-time PCR（定量）。 4. 蛋白水平的检测：蛋白水平的检测一般需要借助抗体