大肠杆菌表达系统的研究应用进展综述.doc

基因工程制药综述 班级：生技132 姓名： 学号： 大肠杆菌表示系统研究进展综述 自上世纪 70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛表示系统。尽管基因工程表示系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,而且多年来出现了很多新型真核表示系统, 不过大肠杆菌仍然是基因表示关键工具。 尤其是进入后基因组时代以来, 相关蛋白结构和功效研究开展 ,对基因表示要求更高,这时大肠杆菌往往是表示第一选择。文章综述了近 年来相关大肠杆菌表示载体及宿主细胞改造工作。 1　表示载体 1. 1　表示调控 构建有效表示载体是表示目标基因基础要求, 同时也是影响基因表示水平和蛋白活性关键原因。标准大肠杆菌表示载体关键组成: 开启子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点和抗性筛选因子等。理想表示载体要求在转录和翻译水平上能够控制目标基因表示 ,然而目标基因在宿主体内过分表示(选择较强开启子等)会对宿主造成压力, 引发相关细胞应答反应, 影响蛋白活性等。基因组、 RNA 转录组、蛋白质组、代谢调控组等领域研究结果给我们提供了大量相关基因表示调控信息[ 1] 。现已能从基因和细胞整体水平来方便地选择适宜开启子或合 理开发新载体系统。譬如 Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学差异,发觉二者全部产生了大肠杆菌热休克蛋白并引发了 cAMPCRP 调整蛋白应答, 其中重组子影响更为强烈；另外, 还发觉外源基因表示使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表示水平、细胞生长率下降 , 而使细胞呼吸活力上升[ 2] 。现在应用表示载体关键问题是 表示过程中出现全或无情况, 通常表示培养物全部是 非纯种细胞群, 其中有部分细胞能够最大程度地被诱导,而另部分细胞在诱导后基因表示被关闭。分离含有适宜强度开启子及翻译速率载体变种能够优化表示水平,说明开启子选择对于基因诱导表示很关键。 Deborahat 提出在芯片上排列含有不一样强度等级开启子载体进行互补分析, 可能有利于筛选最为适合开启子[3] 。开发非 IPTG 或阿拉伯糖诱导载体也能够提升基因表示水平, Qing 等利用 cspA 基因独特征开发了一系列冷休克表示载体 pCold, 使目标基因在低温下(15℃) 诱导表示,提升了产物溶解性和稳定性[4] 。 1. 2　融合表示载体 除了表示载体调控性,为了提升蛋白产物活性和简化下游纯化操作等 ,往往在表示载体上插入其它辅助基因序列和目标基因组成融合蛋白表示。融合信号肽(PelB、Om pA 、MalE、PhoA 等)表示能够使融合蛋白经过经典 Sec 路径分泌到周质或胞外表示, 有利于形成二硫键和避免胞质蛋白酶水解和 N 端甲硫氨酸延伸。 另外,最近开发双精氨酸转运体系(Tat)能够有效分泌正确折叠重组蛋白[5] 。常见纯化标签多依据亲和层析配体来选择,如 6H is、GST 、CAT 、MBP 等经过一步亲和纯化能够得到均一性较高产物, 但化学洗脱会对产物活性产生一定影响。Ca2+依靠钙调蛋白结合肽(CBP)和链球菌亲和素结合肽(SBP)作为纯化标签时, 只需要在洗脱液中移去标签依靠离子或小分子就能实现温和特异性洗脱[6 ,7] 。再者, 应用部分非层析纯化标签在纯化操作中很经济实用, 如热敏型类弹性蛋白多肽 (ELPs)能够使蛋白产物在溶解态和非溶解态之间转变, 后续应用逆转循环纯化方法能够达成亲和纯化回收率[8] 。另外,在纯化标签和目标蛋白之间插入部分特殊短肽,同时融合剪切酶能够在纯化操作中利用标签自剪切直接得到产物蛋白。 比如 SrtAc 酶所识别短肽序列 GTEPL, 在蛋白 N 端依次连接短肽、剪切酶、6His 融合表示,亲和上柱后剪切酶发挥作用使 N 端带有 Gly 目标蛋白从融合状态中释放出来[9] 。噬菌体展示库是表示抗体或其它蛋白库关键克隆技术, 和之相同将目标基因同适 合锚定序列融合能够使产物蛋白表示到大肠杆菌表 面。大肠杆菌展示所用融合配体通常为细菌膜蛋白或跨膜转运体,如 PadL 是大肠杆菌长链脂肪酸一个外 膜转运体蛋白,N 端融合 PadL 表示胞内酶,以全细胞形式催化反应表现出很高稳定性[10] ；Yang 等利用恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida 外膜酯酶 EstA 转运结构域作为表示胞内β-内酰胺酶锚定基序, 结果表明蛋白展示在细胞膜外并没有影响细胞活力[11] 。 1. 3　共表示载体 很多真核基因表示产物全部必需以多聚复合体形式组合才能表现出对应活性, 所以在表示这一类目标基因时候常构建共表示载体,另外共表示策略在辅助新生蛋白质折叠和分泌中也很有意义。Dzinen