流感病毒的快速检验方法.doc

流感病毒快速检测方法 TOC \o 1-2 \n \h \z \u 一、 RT-PCR快速诊疗方法 （一） 生物安全要求 （二） 病毒核酸提取 （三） RT-PCR （四） PCR 产物纯化 （五） 流感病毒RT-PCR检测引物 二、 免疫荧光方法检测流感病毒 （一） 原理 （二） 标本处理 （三） 间接免疫荧光法 （四） 结果判定 三、 实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊疗检测 （一） 基础原理 （二） 试验试剂 （三） 试验步骤 四、 快速诊疗试剂盒 流感快速检测方法，和传统病毒分离判定相比含有快速、简便特点。所以常见于流感暴发时早期病原学检测用。流感快速诊疗包含直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊疗速方法、流感快速诊疗试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊疗速诊疗方法和多个流感快速诊疗试剂盒优缺点。不管那种快速诊疗全部无法替换传统病毒分离判定方法。 RT-PCR快速诊疗方法 核酸检测是一个判定流感病毒基因组有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也能够检测到。本章将介绍检测流感病毒聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必需合成和病毒RNA互补DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA多聚酶，所以，扩增流感病毒基因组过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达成倍增效果。 生物安全要求 生物安全等级和个人防护要求：生物安全二级试验室，防护要求和二级试验室要求相同。并应遵守对应生物安全要求。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时能够在生物安全二级试验室里进行，核酸提取在生物安全三级试验室生物安全柜里完成。 病毒核酸提取 试验材料及仪器 QIAGEN企业Rneasy Mini Kit（Catalog# 74104） β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol） 70% 乙醇 无菌1.5ml 离心管 10μl、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头 可调14K微型离心机 旋转混合器 操作步骤 取1支无菌、无RNA酶1.5ml Eppendorf管，加入500μl RLT。 取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）100μl，加入上述Eppendorf管中。 加5μl β-巯基乙醇，充足混匀。 加600μl 70%乙醇，于旋转混合器混匀。 从试剂盒中取出带滤膜离心柱，并标上标本号。 将第4步混合液体分两次（每次600μl） 吸入于滤柱中，1rpm 离心15秒，弃搜集管中离心液。 滤柱仍放回搜集管上，将第4步混合液全部吸入滤柱中，1rpm 离心15秒，弃搜集管中液体。 于滤柱中加入700μl RW1，1rpm 离心15秒。 从试剂盒中取出一支新2ml搜集管，将离心后滤柱转到新搜集管上，于柱子中加入500μl RPE，1rpm 离心15秒弃搜集管中液体。 滤柱放回搜集管上，于滤柱中加入500μl RPE，13000～14000rpm 离心2分钟。 从试剂盒中取出一支1.5ml Eppendorf管，将滤柱转到新1.5ml管上，于滤柱中加入30～50μl 无RNA酶水，室温静置1～3分钟。 1rpm 离心1分钟，弃滤柱。搜集离心液即为提取病毒RNA，能够直接用于逆转录试验，或在-20℃以下保留，-30℃可保留3～4个月。 注意事项 试剂盒中RPE液用前需加44ml无水乙醇，使终体积达成55ml。 全部用过枪头、搜集管放入2%次氯酸钠消毒缸中过夜。 RT-PCR 一步法 RT-PCR 试验材料 QIAGEN One Step RT-PCR Kit Cat No 210212 RNase inhibitor 40u/μl（Promega） 上游引物 200ng/μl 下游引物 200ng/μl 模板RNA（Templet RNA） 试验步骤 PCR反应配置（在清洁区缓冲间，加RNA模板应在核酸室） 无RNA酶水（Rnase Free Water） 28.75μl 5×Buffer 10μl 10mM dNTP 2μl Enzyme Mix 2μl Rnase inhibitor