第八章真核细胞表达系统.ppt

第八章真核生物表达系统 Eukaryotic expression system 真核细胞表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。 （二）真核生物基因表达调控的特点 1、真核生物基因表达的调控是多方面、多层次的：表达调控多样 2、核内转录，核外翻译，转录和翻译在时间上、空间上是完全分开的。 2、真核基因无操纵子，转录单位一般是单顺反子的，即一个基因一种mRNA一种蛋白质。 （三）真核生物基因表达的调控模式 真核生物的基因调控可以在转录前、转录、转录后、翻译和翻译后五个水平进行。其中转录水平的调控最重要。 1、转录前的调控： 即基因结构上的改变，包括基因丢失、基因重组、甲基化修饰等。 2、转录水平的调控：涉及三种因素 （1）RNA聚合酶Ⅱ （2）順式调控因子（cis-acting factor): 正调控元件：启动子（promoter）、增强子（enhancer） 负调控元件：衰减子（attenuator）、转录终止信号。 （3）反式作用因子（trans-acting factor):蛋白质因子，通过与順式调控元件和RNA聚合酶的相互作用调节基因转录活性。 3、转录后修饰： 去除内含子，带帽，加尾。带帽和加尾均可增强mRNA稳定性，另外，加尾帮助mRNA进入细胞质，带帽则是核糖体结合和翻译起始所必需的。 4、翻译水平的调控： 主要涉及mRNA、tRNA、核糖体和可溶性蛋白因子。 5、翻译后水平的调控： 切除信号肽序列，进行磷酸化、乙酰化、糖基化等化学修饰等。 优点： 3、 哺乳动物细胞易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。4、 可将表达的产物分泌到培养基中，其提纯工艺简单．成本低。5、哺乳动物细胞表达系统是进行基因治疗的唯一受体系统。 哺乳动物细胞表达载体的调控元件 常用启动子(promoter) ： 病毒来源的：SV40（绿猴空泡病毒40）启动子、CMV（巨细胞病毒）启动子、RSV（肉瘤病毒）启动子、LTR（反转录病毒长末端重复序列）启动子。 细胞来源的：HSP（热休克蛋白）启动子、MCK(肌酸激酶）启动子。 SV40启动子宿主范围较广。 哺乳动物细胞表达载体的调控元件 (5) 剪接信号： 经研究发现，mRNA拼接所需的基本序列位于内含子的5’和3’端，在这些基本序列中至少最末端的两个碱基不变，内含子的5’端总是GU，3’端总是AG。 (6) 终止信号和多聚腺苷酸化信号 常用的polyA信号来自SV40 （7）复制元件：可提高外源基因的表达水平。如SV40复制子，用于瞬时而大量表达蛋白。 (1)SV40载体 猿猴空泡病毒40(Simian Vacuolating virus 40，SV40)是乳多空病毒科病毒，基因组为双链环状DNA，含有5243bp。由从SV40病毒 构建出PSV系列载体，可在多种哺乳动物细胞表达。这些载体带有SV40的复制起点，广泛的宿主范围的启动子和poly(A)信号。有些载体同时带有报道基因。 如逆转录病毒表达载体pLPGHL-表达了大鼠生长激素基因（rGH）； pMSV-表达了人的副甲状腺激素基因（hpTH） 缺点：仅整合处于增殖状态的细胞；允许插入外源基因一般8kb;有诱变危险。 (4)腺病毒(AdV)载体: 缺点： 1、免疫原性强，可刺激机体产生免疫反应 2、重组、纯化费时 3、缺乏特异性：几乎可感染所有细胞。 3、新霉素抗性选择系统 新霉素抗性基因(neo)编码一种3′磷酸转移酶，这种酶能使G418失活。 若将neo基因重组到真核细胞表达载体中,在真核细胞中表达的基因产物可使转化了的细胞在含致死量G418的选择培养基中存活．这种选择系统适用于所有的细胞类型。 4、哺乳动物细胞基因转移方式 转染方法 磷酸钙沉淀 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 哺乳动物细胞的病毒转染法 瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组 稳定转染 目的基因整合进宿主基因组 （2）逆转录病毒载体(retrovirus vector) retrovius是一类RNA动物病毒，基因组含有两个相同的 RNA分子，长约8一10kb。逆转录病毒载体的优点是: ?是一种广寄主病毒，而且感染率高。 ?有较大克隆容量(至少6kb)，有较高的克隆效率。 ?具有长的末端重复序列 (1ong terminal repeat，LTR)，5’一 末端有强启动子，并可为外源基 因的转录提供起始和终止信号； ?基因组感染寄主细胞→逆转录产生dcDNA → 整合 寄主染色体，以前病毒形式长