第六章基因克隆.ppt

第六章 基因克隆Gene cloning 基因克隆的操作过程 DNA的体外重组（切、接） 重组DNA分子的转化和扩增（转、增） 转化子的筛选和鉴定（检） 基因克隆的操作过程 第一节DNA的体外重组（切与接） 同种内切酶生产的粘性末端的连接 同尾酶生产的粘性末端的连接 不同粘性末端的连接 粘性末端的更换 人工粘性末端的连接 重组率 重组率 重组率的定义 重组率= 含有外源DNA的重组分子数/ 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。 重组率 提高重组率的方法 提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1 (一般连接反应中外源DNA与载体的比例采用3:1,4:1或5：1） 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：(防止载体自身环化） 重组率 提高重组率的方法 加装同聚尾末端： 第二节重组DNA分子的转化和扩增（转与增） 转化的原理与技术 （1）将质粒引入细菌 （2）将噬菌体引入细菌 （3）酵母细胞内引入基因 （4）哺乳动物细胞引入基因 （5）植物细胞引入基因 转化率 转化细胞的扩增 转化的原理与技术 转化（transformation）：是指将质粒DNA或以质粒为载体构建的重组子导入受体细胞的方法。 常用转化方法：CaCl法，电穿孔法。 转染（transfection）：将噬菌体、病毒或以其为载体的重组DNA导入受体细胞的过程，称为转染。 常用的转染方法：磷酸钙法、脂质体法。 转化的原理与技术 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 1970年，Mandel和Higa等发现，用CaCl2 溶液处理过的大肠杆菌细胞比较容易获得?噬菌体的DNA；1972年，Cohen等也发现用CaCl2 溶液处理过的大肠杆菌能被环状的质粒DNA分子所转化由此建立了用CaCl2 制备大肠杆菌感受态细胞的常规方法。对这种感受态细胞进行转化，每μg质粒DNA可获得5×106～2 ×107个转化菌落 。 1.CaCl2法的原理 可能是 (1)在0℃的CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，诱导大肠杆菌形成感受态。 (2) Ca2+能与加入的DNA分子结合，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42 ℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并使细胞膜出现空隙，此时的细菌易于接受外界DNA, 这种经过处理能够接受外源DNA的细胞成为感受态细胞（copetent cell） 。 电穿孔转化法最早用于将DNA导入真核细胞，1988年，Dower等人成功地应用该法进行了大肠杆菌地转化。 原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。 3.细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化 细菌原生质体的制备： 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例： 细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂 细菌原生质体的制备： 细菌原生质体的转化： 细菌原生质体的转化： 取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10 - 20 μl DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混菌匀 细菌原生质体的再生： 细菌原生质体的再生： 原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素 转化的原理与技术 感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600 = 0.5 In vitro packaging（体外包装）：容易，试剂盒 吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟 转染裂解： 加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选感 酵母细胞的转化 5.30℃ 200 rpm 振荡培养30 min，42℃热激15min，再冰浴10min。 6.30