第四章目的基因的获得及基因组文库的构建.ppt

第四章目的基因的获得与基因文库的构建 第一节已知基因的获得 1.化学合成法 Khorana于1967年发明，是一种利用化学反应合成寡核苷酸链的方法。 20世纪80年代以来，多采用全自动核酸合成仪。 应用：合成PCR引物、测序引物、 DNA探针、合成目的基因 局限性：价格昂贵，少用于合成大片段基因。 2.PCR法 多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种模拟天然DNA复制过程，在体外扩增特异性DNA（或RNA）片段的新技术。 第二节未知基因的获得 1.构建基因组文库(genomic DNA library) ，筛选目的基因 基因组文库（含有全部基因）：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建） 鸟枪法（shotgun）：构建基因组文库，再用分子杂交等技术去钓取基因克隆的方法，称为鸟枪法。 构建基因组文库的方法 1.从生物组织细胞中提取全部DNA 2.用酶法或超声波法将DNA切成预期大小的片段 3.将片段与适当的载体连接:构建大片段基因组 DNA 文库使用的载体主要有 λ 噬菌体、粘粒载体、细菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体 YAC（YACs）、 P1 （Bacteriophage P1）和 PAC 4.重组 DNA 转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； 5.阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 BAC 文库的构建流程图 文库的质量检测:代表性 代表性是指文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。 代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。 提高文库代表性的两个策略 一是采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体 DNA ，以保证克隆的随机性，保证每段 DNA 在文库中出现的频率均等 。 二是提高文库所含基因组 DNA 的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量 为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目， Clark 和 Carbon 于 1975 年提出如下的计算公式：??????N=ln（1-p）/ln（1-f）??????N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数??????p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率??????f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组 DNA 大小的比值 举例来说，用BAC载体构建人类基因组文库，人类基因组大小为3 x 109 bp, 插入片段大小为100kb，希望覆盖率99%，那么所需要的BAC克隆数为N = ln (1 - 0.99) / ln (1 - [106bp / 3 x 109 bp]) = -4.61 / -3.33 x 10-6 = 138,298 除了尽可能高的代表性外，一个理想的基因文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力（克隆片段约100Kb） 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔。载体的装载量最好大于基因的长度 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利克隆排序。克隆与克隆之间必须存在足够 克隆片段易于从载体分子上完整卸下。克隆片 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。 组克隆能稳定保存、扩增、筛选 2.构建cDNA文库(complementary DNA library) ，筛选目的基因 cDNA文库：包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆的集合。 cDNA文库去除了不编码的非结构基因（如内含子、启动子），比基因组文库小得多，易于筛选。 cDNA文库构建流程 ??第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；??第二，第一链 cDNA 合成；??第三，第二链 cDNA 合成；??第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。 cDNA 第一链的合成 由 mRNA 到 cDNA 的过程称为反转录 反转录由反转录酶催化。常用的反转录酶有两种，即 AMV （来自禽成髓细胞瘤病毒）和 MMLV （来自 Moloey 鼠白血病病毒） Oligo（dT）引导的 cDNA 合成是在 cDNA 的合成过程中加入高浓度的 Oligo（dT）引物， Oligo（dT）引物与 mRNA 的 3 末端的 poly（A）配对，引导反转录酶以 mRNA 为模板合成第一链 cDNA 。这种 cDNA 合成的方法在 cDNA 文库构建中应用极为普遍 cDNA 第二链的合成 自身引导合成法 置换合成法 引导合成法 引物－衔接头合成法。 自身引导合成法 首先用氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链，解离的第一链 cDNA 的 3-末端就会形成一个发夹环，并引导 DNA 聚合酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连接在一起的，再利用 S1 核酸酶将连