流式细胞仪及其应用.ppt

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一 流式细胞仪原理 流式细胞术原理 流式细胞仪基本结构 流式细胞仪的配套设备 流式细胞术的基本概念与基本原理 流式细胞术(Flow Cytometry, 简称FCM)是一种可以快速、准确、客观,并且同时检测单个微粒(通常是细胞)的多项特性的技术,同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒,如各种细胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征,并加以定量 流式细胞仪的特点 单个细胞分析 同时多参数分析 速度快:10000个细胞/秒 统计学意义:提供细胞群体的均值和分布情况 分选感兴趣的细胞 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 荧光信号 荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放,转换为振动能和热能,释放较入射光波长更长的光量子 荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多,产生的荧光信号越强 散射光信号 前向角散射光(FSC, Forward Scatter) 细胞相对大小及其表面积 侧向角散射(SSC, Side Scatter) 细胞粒度及细胞内相对复杂性 荧光信号 外周全血细胞散射光双参数点图 (红细胞裂解后) 流式细胞术样本来源 细胞悬液: 分离PBMC、PRP等:操作复杂,分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失,并可能引入某些误差 直接使用外周血、骨髓:最接近生理状况,操作简便,样本用血量小 灌洗液、体腔积液 培养细胞、细胞系 实体组织:Medimachine 病理组织:新鲜样本/石蜡包埋样本 针吸组织:新鲜样本 鞘液、洗液、PMA等:清洁无颗粒杂质 单细胞悬液的处理 荧光标记抗体的染色:使用特异的单克隆抗体 单色分析:直接标记、间接标记 双色分析:SimulSET IMK、HLA-B27 多色分析:TriTEST、MultiTEST、ProCOUNT 溶血:FACS Lysing Solution 细胞打孔:FACS Perm2 固定:1%多聚甲醛 荧光染色 染色要求: 特异识别某一群细胞,有效区分不同细胞亚群 非特异反应水平低 抗体校价高,用量适用于常规标本 使用特异的单克隆抗体 最好使用荧光直接标记的抗体 采用适当的阴性对照物 抗体最适滴度 流式细胞仪的组成 仪器硬件组成 计算机硬件系统 软件系统 应用 台式机——FACSCalibur 双激光 488nm 635nm 四荧光参数 分选细胞富集系统 FACSCalibur 分析速度快,达10000个细胞/秒,是目前最快的台式机 双激光立体空间激发系统 ,实现完美的4色荧光分析 DDM双粘体辨别模式:DNA分析的解决之道 独特的分选功能及浓缩系统 灵活的设计,提供多种配置 配套设施 数据处理系统——Macintoshi系统 Autoloader自动进样系统: 40管轮盘,软件支持,简单易操作,真正实现无人操作 样本制备仪: 免疫样本制备仪 DNA样本制备仪 流式细胞仪仪器结构 液流系统 光学系统 激光光源 光收集系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统 FACSCalibur流式细胞仪液流系统 流式细胞仪的光学系统 激光 (Laser)是一种相干光源,它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照 激光波长: 488nm, 635nm 光收集系统是由若干组透镜, 滤波片, 小孔组成,将产生的光信号引导至检测器 DDM检查——区分双粘体细胞 流式细胞仪的电子系统 进行信号检测和分析 当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时, 受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收,转变为电信号,可分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机,进行储存、 作图、 统计分析 流式细胞仪的电子系统 荧光信号的面积和宽度信号: 面积信号:对检测到的荧光光通量进行积分得到的测量值,用于细胞DNA含量、RNA含量的测量 宽度信号:荧光光脉冲信号的时间 强大的数据处理系统 Macintoshi系统,灵活多样的图形处理能力 强大的软件支持,灵活方便的数据处理功能 仪器自动校检软件FACSComp 主软件CELLQuest 全面的自动化临床应用软件: 淋巴细胞自动检测软件SimulSET;MultiSET 干细胞自动检测软件ProCOUNT HLA-B27; ModFIT; QuantiBRITE 流式细胞仪数据分析 数据显示: 直方图 ( Histogram ) 二维点图(Dot Plot) 等高线图(Contou

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