细胞培养基本技术2.ppt

细 胞 培 养 基 本 技 术 韩 纪 举 泰山医学院基础医学研究所 细胞传代方法 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1.悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 .半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹 打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3.贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。 贴壁生长细胞传代方法： 1、 吸光培养瓶中的培养液 2、加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 3 、 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 4 、用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 5、 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 6 、加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 7 、将后者放入培养箱中培养。 细胞传代需注意的问题 操作全过程注意无菌操作 胰酶消化时间适度 吹打细胞用力要适度 细胞培养的生长测定 细胞计数法 细胞克隆形成率实验 胎盘兰染色法 MTT比色法 细胞生长曲线法 3H－TdR掺入法 BrdU掺入法 细胞计数法 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数 血球计数板 计算方法： 细胞密度（个/ml)＝10大格的细胞总数×103 ×稀释倍数 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠 台盼蓝法 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。 用胎盘兰染色可以区分死、活细胞。 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力 操作步骤 0.5ml胎盘兰＋0.3ml培养液＋0.2ml细胞悬液 染色5－15min 计数500个细胞中着色细胞数 细胞活力=（总细胞数－着色细胞)/总细胞数×100％ 四唑盐（MTT）比色法 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝， 四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试 验、肿瘤放射敏感性实验等。 操作步骤 加入培养液量10％的MTT(5g/L)，继续3～4h培养 吸去培养液，加入等量异丙醇或DMSO，振荡10min 490/630nm 测定OD值 细胞存活率＝实验组OD值/对照组OD值×100％ 操作步骤 （1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％ CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间） （2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。 （3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。 （4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长为570 nm）。记录结果，绘制细胞生长曲线 细胞生长曲线法 观察同一代细胞的增殖过程，根据细胞生长曲线分析细胞的增殖速度，确定具体实验、细胞传代、细胞冻存的最佳时间。 实验步骤 计数细胞浓度，等量加入培养板各孔，培养7天 每隔24h，计数3孔细胞数目，取均值 以横坐标为培养时间(D)，纵坐标为细胞浓度（×104 /ml) 注：1、各孔消化时间应一致。 2、计数细胞前应混匀。 细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。