细胞培养基本技术3.ppt

细 胞 培 养 基 本 技 术 韩 纪 举 泰山医学院基础医学研究所 教学目的和意义： 本课程的教学对象包括各科的研究生，教学任务由口腔生物学教研室担任。由于细胞培养技术作为实验、研究工作的基本技术已广泛应用于各学科的多项领域，因此本课程的目的为：通过学习，使学员了解细胞培养的基本知识，初步掌握基本的培养技术及观察、检测方法，为其今后进一步学习及科研、实验创造基础。 教学要求： 本课程以实验操作为主。因此，教学中应讲清基本知识，实验示教要规范，并要组织好学员的实习操作。学员学习时应在了解基本知识的基础上，认真地按要求实际操作，以初步掌握各项实验技术的原则和要领 一、细胞培养的基本原理 二、实验用品及用途 三、各种实验用品的清洗与消毒 四、各种液体的配制 一、细胞培养的基本原理 组织培养概念： 在无菌条件下,从动物(植物也可)或在人体中取出组织或细胞,置于模拟体内的生理环境中(无菌,适当的温度和一定的营养条件)使之生存和增殖生长的技术方法. 用于研究细胞、组织的代谢、增殖、分化、形态和功能变化，各种理化因子对活细胞的影响 组织细胞培养的取材 组织培养:使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片 （厚0.2 毫米） 细胞培养：使用单个细胞悬液 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个 器宫 培养细胞的生长方式 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。 贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞 培养细胞的形态 上皮型细胞：此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有园形核，细胞紧密相连单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮型形态生长。 成纤维型细胞 ： 在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。  游走型细胞：本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。 常见于羊水细胞培养的早期 原代培养细胞的生命归宿 原代培养期 传代期 衰退期 原代培养: 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养 传代培养： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 衰退期：??? 此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。 细胞株（cell?strain）： ? 是由具有某些特性与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系，这些特性或标志在尔后的培养中必须保持下去。 细胞系（cell line）： 原代培养物经首次成功后即成细胞系。它由原先已存在于原代培养中的细胞的许多谱系组成。 如果不能继续传代或传代数有限称为有限细胞系。 如可连续传代称为连续细胞系  每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。 此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟一4小时 贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟～4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等。 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） 贴附过程 ：3步 贴附因子粘附 细胞开始附着 细胞进一步 牢固附着—伸展 潜伏期 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一 般为6～24小时。 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行 实验研究。 停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: