第二章基因工程中的工具酶.ppt

第二篇基因工程的基本条件 基因工程中的工具酶 基因工程中的载体 基因克隆或表达的受体 第二章 基因工程中的工具酶 核酸酶（nucleases)—切开、切除或降解核酸的酶 。包括内切酶和外切酶 DNA连接酶(ligases)—用于DNA和RNA的连接 DNA聚合酶(polymerases)—用于DNA和RNA的合成 核酸末端修饰酶(modifying enzymes)—用于DNA和RNA的末端修饰 拓扑异构酶（topoisomerases):向共价闭合环状DNA中引入或消除超螺旋。 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等 核酸酶 核酸酶通过打断DNA链中连接相邻核苷酸的磷酸二酯键来水解DNA分子。 外切酶 Bal 31 Exonuclease III 内切酶 S1 核酸酶 脱氧核糖核酸酶I （DNase I） 限制性内切酶 限制性内切酶Restriction endonucleases  限制性内切酶的发现及其功能 限制性核酸内切酶的发现 20世纪50年代，观察到一些细菌菌株对噬菌体的侵染表现出免疫力，这种现象称为宿主调控性限制（host-controlled restriction) 1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出Hind II和Hind III 目前，已有超过1200种不同的限制性内切酶被确定。 限制性内切酶的命名 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 H i n d II H i n d III 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 限制性内切酶的类型 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 　例如：HindⅢ　　前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 限制性内切酶的定义 限制性内切酶的定义 通常指Ⅱ型限制性核酸内切酶。识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA链,主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵。 限制酶的识别特点 1. 识别顺序和酶切位点 １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起 ２）富含ＧＣ 常用的限制性内切酶的识别序列 末端种类 １）３’粘性末端３’-端突起，个数为２或４个核苷酸 Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’ 3’-GACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’ ２） ５’粘性末端５’-端突起，个数为２或４个核苷酸 EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-GOH PAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAAP HOG-5’ ３）?平齐末端 SmaI 5’-CCCGGG-3’