第七章原核细胞表达系统.ppt

第七章原核细胞表达系统 Chapter 8 Prokaryotic expression system 一、基本概念 根据受体细胞的不同，表达系统分为原核表达系统和真核表达系统。 原核细胞表达系统：将克隆的外源基因导入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵的方式快速、高效地表达、合成基因产物的体系。 原核细胞表达系统中的受体细胞主要有大肠杆菌、链霉菌和枯草杆菌。 真核细胞表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。 启动子的可控性 乳糖启动子Plac的可控性： 野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高 启动子的可控性 色氨酸启动子Ptrp的可控性： 色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸， 或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因的表达 启动子的可控性 λ噬菌体启动子P λL的可控性： 噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型的cI突变基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋白在42℃时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达。但在大型细菌培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达 2.终止子强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率 终止子 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的T φ。 SD 原核操纵子 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素 位相载体----含有3种读码框的系列载体 Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物切割方便： pGEX-1?T—凝血酶 pGEX-2T---凝血酶 pGEX-3T---X因子 位相载体 融合型载体----pGEX系列 GST:谷光甘肽巯基转移酶基因 以融合形式表达目的蛋白的优缺点 目的蛋白稳定性高尤其对分子量较小的多肽效果更佳 目的蛋白易于分离利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白 目的蛋白表达率高与受体蛋白共用一套完善的表达元件 目的蛋白溶解性好由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性 目的蛋白需要回收融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获得目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段 （二）非融合型表达载体 P SD Foreign DNA 非融合型表达载体 非融合基因 主要元件：强启动子 SD： ATG：第一个密码子 外源基因 终止密码子 非融合型表达载体----Pkk177-3 非融合型表达载体的特点： 非融合蛋白在胞内表达时，往往会形成包涵体 （Inclusion Bodies，IB） 。 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露