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HPLC方法的建立和选用;目录;3 色谱条件的选择
3.1 流动相的选择
3.2 检测器的选择
3.3 样品的溶解及预处理
3.4 样品的进样量
3.5色谱柱的选择及保护与再生
3.6 泵的选择
3.7 色谱工作站
4 分析方法建立的实例
4.1 等度分析
4.2 梯度方法的建立
4.3 色谱柱及pH的影响;5 色谱分析中各种图谱现象的判断和处理
5.1 基线噪音的产生和处理
5.2 基线漂移(上漂和下漂)
5.3 倒峰的产生和消除
5.4 鬼峰的产生和消除
5.5 峰前移和退后的判断
5.6 前沿峰和拖尾峰的判断
5.7色谱双峰的判断
5.8 色谱峰变胖的判断和处理;1 前言;2 HPLC方法建立的步骤;HPLC方法的建立和选用;2.1 了解样品的有关情况;1 分析大分子、小分子还是生物分子
一般常规的HPLC分析分子量2000以下,大分子一般采用凝胶色谱(包括凝胶过滤、离子交换、亲和层析、疏水层析)、生物大分子采用不能变性的色谱体系。
2 样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。
如果是天然物质,一般分离完全采用梯度体系。混合物中是否有结构类似的异构体,组分复杂的还是采用梯度,是否是系列反应的产物。
3 测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。
主含量的测定一般比较容易;但少量要考虑分离完全的问题;痕量成分则要考虑检测器的类型,采用何种提取方法和检测的灵敏度等。
;4 分离化合物是极性,弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物。
非极性化合物以正相体系较多,如果溶于反相体系的溶剂,可采用反相体系。
弱极性、极性化合物采用反相较为方便,可在流动相中添加改性剂,调节合适的pH。
离子化合物可以采用离子交换,也可添加离子对试剂;或者采用反相调节pH 。
两性化合物中水溶性差的可采用反相;但在反相出峰快的则考虑离子交换;也可考虑衍生后测定。
对于极性的糖类物质,可用NH2柱,有条件的用聚合物的糖柱。多糖类的则要采用凝胶系统。
大分子的极性化合物、离子化合物,往往采用特定的色谱柱,多为聚合物柱子。
手性化合物,则要用手性流动相或者采用手性柱。
;5 样品的溶解度、沸点
样品在不同溶剂中的溶解度,对色谱条件的选择非常重要,测定其溶解的性能,则可以判断???化合物可能的类型。
非极性样品不溶于水,但溶于有机溶剂。如果只能溶于非极性溶剂,一般建议做正相。溶于极性溶剂,以反相为上策。极性化合物在水和极性溶剂中一般都有一定的溶解度。
极性和离子化合物一般都溶于水,但在不同pH下区别可能很大。
从溶解度可以判断出采用何种体系为佳。
易挥发性的低沸点的物质在ELSD中难以检测。;6 样品的稳定性
如果样品存在水解、光解、醇解、氧化、分解则测定时需注意。
对光敏感物质,用棕色瓶避光保存,不宜存放过久,随配随做。
易水解的物质,、要选择合适的溶解溶剂。
有些样品可能存在醇解,流动相不能用甲醇,而要用乙腈。
易氧化的物质,溶解时可考虑加抗氧剂,调节pH,如PAP(对氨基苯丙酮)的测定。胺类化合物。
产品不稳定的化合物,分析越快越好。
;7 化合物的化学结构(官能团)
常见的基本结构是苯环、杂环、多环芳烃。基团有COOH、OH、NH2、SO3H、Cl(Br)、CHO、CO、CH3、C2H5、N=NH、SO、SO2、-O-等。
亲水性的基团在反相中出峰时间前移,疏水性的基团出峰后移。
从存在的结构可以判断出其在溶剂中的溶解度。
8 化合物的pK 值
知道pK值,有助于方法的建立,尤其流动相pH的选择。
pK的差异是官能团造成的。
;9 UV光谱图
知道其吸收波长的曲线有助于检测,如果有DAD则关系不大。多组分的样品,宜多选几个波长。
同一样品在不同的流动相及pH最大波长可能不一致。
有双键共轭的结构紫外吸收较大,单键的则在低紫外区有一定的吸收
10 样品的复杂层度
梯度方法分析
预处理,分成几个部分分析
痕量物质的富集
总之,充分了解了被分离样品的性质,将可能提供一个参考的分析条件,缩短分析时间和分析难度。
;2.2 明确分析目的;2.3 样品的预处理与检测;2.4 HPLC分析模式;2.5 色谱条件;2.6 方法的优化,及色谱现象的解析和处理;2.7 定性和定量方法的建立及论证;3 色谱条件的选择;离子对试剂
对强碱性和酸性的离子化合物,除了采用离子交换色谱外,也可在流动相中添加离子对试剂,用C18柱进行分离。
离子对试剂可分为二大类酸性和碱性
分离多羧基、磺酸基的化合物一般添加长链的胺盐,如四丁基氢氧化胺、四丁基溴化胺、四丁基氯化胺等。
还可以添加Na2SO4等无机盐,调节合适的pH。
分离碱性的胺类化合物,一般添加八烷基磺酸钠,十二烷基磺酸钠等。
;反相色谱试剂
有机试剂最主要的是甲醇、乙腈、其他的有四氢呋喃、异丙醇,乙醇
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