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酶基因的随机突变 1引言： 酶分子的定向进化简称为酶定向进化，是模拟自然进化过 程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变， 建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下， 定向选择得 到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。 酶定向进化的基本过程包括随机突变，构建基因文库，定 向选择等步骤。酶的定向进化的第一步是在体外人为的进行积阴 德随机突变，以获得丰富多样的突变基因， 为后续的定向选择打 下基础。 酶基因的体外随机突变首先要获得酶基因，然后在体外进 行随机突变，体外随机突变的技术多种多样，主要有易错 PCR 技术，DNA重排技术，基因家族重排技术等。 这些突变方法的目标都是为了获得丰富多样的突变基因， 但是各自采用的进化策略和侧重点有所不同， 易错PCF技术是从 酶的单一基因出发，通过改变聚合酶链式反应的条件， 如改变底 物和镁离子浓度等，在PCR扩增过程中，使碱基配对错误而引起 基因突变；DNA重排技术是从两条以上的正突变基因出发，经过 酶切和不加引物的PCFT增，使DNA碱基序列重新排布而引起的 基因突变；基因家族重排技术是从基因家族的多个同源基因出 发，经过酶切和不加引物的 PCRT增等，使DNA勺碱基序列重新 排布而引起基因突变。这些随机突变方法可以单独使用， 也可以 联合使用，交叉进行，通过多次试验，反复筛选，就可以完成对 酶的定向进化。 2 酶基因的随机突变常用技术： 2.1，易错PCR技术：在DNA聚合酶的作用下进行体外 DNA扩增的一种 分子生物学技术，简称为 PCR技术。聚合酶链式反应技术的基本过程包括双链 DNA的变性，引物与单链 DNA退火结合，引物延伸三个步骤。 2.1.1，双链DNA的解链：将待扩增的模板 DNA升温至85~95度，使DNA 双链之间的氢键断开，解离为单链 DNA。 2.1.2,引物与单链DNA退火结合：单链DNA在温度逐步降低至50~70度是, 会与碱基互补的引物结合形成双链，长度为 15~30个碱基。 2.1.3,引物延伸：引物结合后，将温度升高至 70~75度，在DNA聚合酶的 作用下，以引物为起点，以4种脱氧核苷三磷酸为底物，以目标 DNA为模板， 按照碱基配对原则，由5—端向3—端的方向延伸，而进行 DNA复制。 以上三个步骤反复进行，一般经过30次循环，即可使目的基因扩增几百万 倍。在PCR技术的基础上，通过改变反应条件，增加碱基配对错误的出现频率， 就成为易错PCR技术。 2.2 DNA重组技术：又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离 得到的同源DNA，勇酶切割成随机片段，经过不加引物的多次 PCR循环，是 DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。 DNA重排技术是1994 年由斯田沫等首次提出，他们通过该技术对 B—内酰胺酶进行了定向进化研究， 是该酶的催化效率提高了 32000倍。DNA重排技术的基本过程如图所示： ［两条以上 ［两条以上 正突变基刃］ 1 ! | DNARfin片民阡 采 Bl 少 圈k 3 DNA川川〃4的為本ilH 2.3基因家族重排技术：又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源 基因出发，勇酶切割成随机片段，经过不加引物的多次 2.3基因家族重排技术：又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源 基因出发，勇酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR技术，使DNA的碱 基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程。基因家族重排技术的主要过程 如图所示： 3酶基因随机突变的应用： 酶基因的随机突变时酶定向进化的第一步，所以特别重要。定向进化技术主要用于酶的改性方面，如提高酶催化的效率，增强酶的稳定性，改变酶的底 物特异性等方面。 3.1提高酶的催化效率：B—内酰胺酶是一种催化B—内酰胺水解的酶，在该 酶的作用下，可使B—内酰胺类抗生素的内酰胺结构被破坏而失去活性。 1994 年，斯田沫等通过DNA重排技术进行定向进化，使B—内酰胺酶的催化效率提 高32000倍，大大提高了突变菌株对于抗生素的耐受能力。 3.2增加酶的稳定性：a—淀粉酶是一种在食品、医药、轻工等领域有广泛用 途的催化淀粉水解的工业用酶，乔耶等通过定向进化，获得热稳定性大大提高的 a—淀粉酶，该酶在90度的半衰期延长9~10倍。 3.3改变酶的底物特异性：底物特异性是酶催化作用的最重要特性，通过酶定 向进化可以改变酶催化作用的底物特异性， 使酶对某种底物的特异性提高或者降 低，甚至呈现出另一种酶的催化活性。