实习实训库、K210 食品微生物检验技术、K209 农产品微生物检验技术 配套项目实训手册、配套项目实训手册、项目操作实训指导书 项目实训手册-项目7-三文鱼中副溶血性弧菌检验.doc

农产品与食品质量检测技术教学资源库 PAGE 9 《农产品微生物检验技术》课程实训指导手册 项目七 三文鱼中副溶血性弧菌检验 （依据GB 4789.7—2013副溶血性弧菌检验） 一、实训目的 掌握副溶血性弧菌的特征与生物学特性，副溶血性弧菌国标检验方法及检验操作程序，明确副溶血性弧菌检验操作要点，熟练使用干制生化鉴定试剂盒和API 20E试纸条进行生化鉴定。 二、实训原理　 采用选择性培养基对目标菌进行增菌培养，然后生化鉴定进行定性或定量检验。对于农产品中副溶血性弧菌的检测主要是将培养分离后的菌落通过菌落形态观察、菌体形态观察、初步生化鉴定及确定生化鉴定实验进行鉴别和判定。 三、实训要求 本项目样品中副溶血性弧菌检验依据GB 4789.7-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》进行检验操作以及按照GB 29921-2013《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》进行评价。本项目全面考察学生依据国标对样品中副溶血性弧菌进行定性或定量检验的能力，实施过程均可分成检验准备、检验操作、结果与报告四个部分。定性与定量检验的操作鉴定操作部分相同，均包括增菌、分离、纯培养、初步鉴定、确定鉴定5个步骤。本项目按4人/组为单位进行操作，要求在实验室完整进行样品中副溶血性弧菌的检验。 四、实验材料和设备 试剂和溶液 2.1选择性增菌试剂 3％氯化钠碱性蛋白胨水； 2.2分离平板 硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂平板、弧菌显色培养基；注意：这两种选择性培养基均不可过度加热；使用前一天配制，且在48h内使用；倾注平板前需摇匀；不能反复溶解，平板需避光保存于室温环境； 2.3纯化平板 3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂； 2.4初步鉴定生化试剂 氧化酶试剂、革兰氏染色液、3％氯化钠三糖铁（TSI）琼脂斜面、3%氯化钠半固体培养基、嗜盐性试验培养基； 2.5确定鉴定生化试剂 3％氯化钠甘露醇试验培养基、3％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基、3％氯化钠MR-VP培养基、Voges-Proskauer（V-P）试剂、3％氯化钠溶液、ONPG试剂； 2.6系统生化鉴定试剂 副溶血性弧菌干制生化鉴定试剂盒（包括3%氯化钠三糖铁（TSI）、3%氯化钠半固体、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、无盐胨水、6%盐胨水、8%盐胨水、10%盐胨水、氨基酸对照、赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、V-P、ONPG及辅助试剂（无菌石蜡、V-P甲、乙液试剂、糖发酵添加剂））、API20E生化鉴定试剂条及其辅助试剂（无菌石蜡、TDA试剂、JAMES试剂、V-P甲、乙液试剂） 2 仪器和设备 2.1实验设备 天平、均质器、超净工作台、生物安全柜、显微镜、恒温恒湿培养箱； 2.2实验用具 无菌吸管、微量移液器及吸头、无菌手术剪、镊子、接种环。 五、实训任务（包含结果计算） 定性检验 1、样品制备 在无菌室内，以75%酒精擦拭外包装，尤其是包装开口处，用无菌剪刀在样品封口处剪开外包装，换一个无菌剪刀，将三文鱼样品剪碎至无菌罐中，用无菌镊子夹取并称取25 g样品至盛有3%氯化钠碱性蛋白胨水225 mL中，转入注明样品信息、检测人员以及检测日期的均质袋中，密封，用拍击式均质器拍击2 min。若样品为液态，不需均质，振荡混匀即可；鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃；贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃；如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分；3%氯化钠碱性蛋白胨水为选择性增菌液，其高浓度盐含量可抑制除嗜盐微生物外的其他微生物生长。 均质完毕的样品通过传递窗出无菌室，清理无菌室，打开无菌室紫外灯，辐照灭菌30 min。非冷冻样品采集后应立即置7 ℃～10 ℃冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45 ℃以下不超过15 min或在2 ℃～5 ℃不超过18 h解冻。 将上述均质完成的检测样品置于预先设置36 ℃的恒温恒湿培养箱中培养8 h～18 h。 2、分离 病原微生物分离鉴定工作应在BSL-2实验室生物安全柜中进行。 用接种环在距离增菌液液面以下1 cm 内沾取一环增菌液，分别划线接种TCBS琼脂平板或弧菌显色培养基平板上。本片将分别演示这两种平板的分离现象。 接种完成后，置于36 ℃的恒温恒湿培养箱中培养 18 h～24 h，待观察。副溶血型弧菌在TCBS琼脂平板上培养一般不超过24 h，随培养时间的延长，一些非目标菌（如霍乱）代谢产生的酸会不断挥发，同时代谢蛋白胨产生一定的碱性物质，两者综合导致菌落由黄色逐渐向蓝绿色转变，从而引起误判现象。所以应尽快（不超过1h）挑取菌落或作标记； 副溶血性弧菌在各分离平板上的菌落特征如下: TCBS琼脂平板上呈