土壤酶的测定方法..docx

一、脲酶测定 (苯酚钠 -次氯酸钠比色法 ) 脲酶是对尿素转化起关键作用的酶， 它的酶促反应产物是可供植物利 用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。 1、试剂配制： （ 1） pH6.7 柠檬酸盐溶液：取 368g 柠檬酸溶于 600mL 蒸馏水中，另取 295g 氢氧化 钾溶于水，再将两种溶液合并，用 1N 氢氧化钠将 pH 调至 6.7，并用水稀释至 2L。 （ 2） 苯酚钠溶液： 称取 62.5g 苯酚溶于少量乙醇中， 加 2mL 甲醇和 18.5mL 丙酮， 后 用乙醇稀释至 100mL （ A 液），保存再冰箱中。称取 27g 氢氧化钠溶于 100mL 水中（ B 液），保存于冰箱中。使用前，取 A 、B 两液各 20mL 混和，并用蒸馏 水稀释至 100mL 备用。 （ 3） 次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为 0.9％，溶液稳定。 （ 4） 10％尿素溶液： 10g 尿素溶于 100mL 水中。 （ 5） N 的标准溶液： 精确称取 0.4717g 硫酸铵溶于水稀释至 1L ，则得 1mL 含 0.1mgN 的标液，再将此液稀释 10 倍制成氮工作液（ 0.01mg/mL ）。 标准曲线绘制 ：分别取 0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5mL 氮工作液置于 25mL 刻度试 管中，加蒸馏水至 10mL ，再加 2mL 苯酚钠溶液和 1.5mL 次氯酸钠溶液， 随加随摇匀， 20min 后显色，定容 25mL 。 1h 内再分光光度计上于 578nm 处比色。 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 工作液 /ml 0 0.5 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 苯酚钠 /ml 2 2 2 2 2 2 2 2 次氯酸钠 /ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 蒸馏水定容 25 25 25 25 25 25 25 25 氨态氮量 / μg 0 55 15 25 35 45 55 65 A 578-1 0 0.054 0.148 0.263 0.339 0.433 0.514 0.569 A 578-2 0 0.052 0.159 0.264 0.371 0.422 0.507 0.556 平均 0 0.053 0.154 0.264 0.355 0.428 0.511 0.563 70 y = 113.58x - 2.6439 60 2 50 R = 0.9926 40 30 20 10 0 0 0.2 0.4 0.6 2、操作步骤 （ 1）称取 2.5ｇ土置于 25mL 刻度试管中 , 加 0.5mL 甲苯处理 ,加塞塞紧轻摇 15min; 往瓶中加入 2.5mL10% 尿素液和 5mL 的柠檬酸盐缓冲液 (ｐＨ 6.7),仔细混匀。在 37℃恒温箱中培养 3ｈ。（当脲酶活性为 3~80 微克 NH3-N 时，本法能获得可靠的结果。 若脲酶活性小于 3 微克，培养时间需增至 24h）。 2）然后用热至 38℃的蒸馏水稀释至刻度 (甲苯应浮在刻度以上 ),摇荡 ,将悬液过滤。 对每一土样， 设置用水代替基质的对照。对整个实验，进行无土壤基质的对照，以检验实验的 纯度。 （ 3）取滤液  0.5mL  置于  25mL  刻度试管中  ,用蒸馏水稀释至  5mL, 然后加入  2mL  苯酚钠 溶液 ,并立即加入  1.5mL  次氯酸钠溶液，加入每一试剂后  ,立即将混合物摇匀  ,20ｍｉｎ后  ,将 混合物稀释至刻度  , 4）在波长 578ｎｍ处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差 ,根据标准曲线求出氨态氮量。 3、结果计算 以 3/24 小时后 1g 土壤中 NH 3－ N 的质量（ mg）表示脲酶活性（ Ure ） Ure＝ a· V · n/m 式中： a 为由标准曲线求得的 NH 3－ N 浓度（ mg/mL ）； V 为显色液体积（ 50mL ） 0.5； n 为分取倍数 50； m 为烘干土重（ g） 2.5。 注意事项： 1. 每一个样品应该做一个无基质对照， 以等体积的蒸馏水代替基质， 其他操作与样品实验 相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。 如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。 二. 过氧化氢酶测定 (紫外分光光度法 ) 试剂配制 0.3％过氧化氢溶液：按 1:100 将 30%H 2O2 用水稀释 b. 1.5N  硫酸：取  42mL  浓硫酸，稀释后定容至  500mL c. 0.02