质粒DNA的提取、酶切与鉴定.docx

实验二十一 质粒 DNA的提取、酶切与鉴定 一、质粒 DNA 的提取 [原理 ] 分离质粒 DNA 的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集 和裂解细菌；分离和纯化质粒 DNA 。 本实验采用碱变性法抽提质粒  DNA ，是基于染色体  DNA  与质粒  DNA  的变 性与复性的差异而达到分离目的。在  pH  高达  12.6 的碱性条件下，染色体  DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒 DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺 旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。 当以 pH4.8 的醋酸钾高盐缓冲液去 调节其 pH 至中性时，变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而 染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体 DNA 与不稳 定的大分子 RNA 、蛋白质 -SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。 [试剂 ] 1.溶液 I： 50mmol/L 葡萄糖、 10mmol/L EDTA 、 25mmol/L Tris-HCl pH8.0; 用前加溶菌 酶 4mg/ml。 2.溶液 II ： 200mmol/L NaOH 、 1% SDS。 3.溶液  III ： pH4.8  醋酸钾缓冲液  （60 ml  5mol/L  醋酸钾、  11.5ml  冰醋酸、 28.5ml 蒸馏水） 4.TE 缓冲液  pH8.0 5.含  RNaseA 的 TE  缓冲液： TE  缓冲液含  20μ g/ml RNaseA。 6.苯酚：氯仿（  1：1，v/v ）：酚需在  160℃重蒸，加入抗氧化剂  8-羟基喹啉，使 体积分数为  0.1%，并用  Tris-HCl  缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿  /异 戊醇为  24：1（v/v ）。 7.1×LB  溶液 8.100μ g/ml 氨苄青霉素 [器材 ] 1.TGL-16  型台式高速离心机 2.1.5ml 塑料离心管 3.离心管架 4.微量移液器 5.常用玻璃器皿 [操作步骤 ] 1.培养细菌 将带有质粒 pUC19 的大肠杆菌接种于 5ml 含 100μg/ml 氨苄青霉素 的 1×LB 中， 37℃培养过夜。 2.取液体培养菌液 1.5ml 置塑料离心管中， 10 000r/min 离心 lmin ，去掉上清液。 加入 150μ l 溶液 I ，充分混匀，在室温下放置 10min。 3.加入 200μ l 新配制的溶液 II ，加盖后温和颠倒 5~10 次，使之混匀，冰上放置 2min。 4.加入 150μ l 冰冷的溶液 III ，加盖后温和颠倒 5~10 次，使之混匀，冰上放置 10min。 5.用台式高速离心机， 10 000r/min 离心 5min，将上清液移入干净的离心管中。 6.向上清液中加入等体积酚 /氯仿（ 1：1，v/v），振荡混匀，转速 10 000r/min，离 心 2min，将上清液转移至新的离心管中。 7.向上清液加 5mol/LNaCl 至终浓度为 0.3mol/L ，混匀，再加入 2 倍体积无水乙 醇，混匀，室温放置 2min，离心 5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸 水纸上，吸干液体。 8.加 0.5ml 70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。 9.加入  50μl  含 RNase A 20μg/ml  的 TE 缓冲液溶解提取物，室温放置  30min 以 上，使  DNA  充分溶解待用或置  -20℃备用。 二、质粒 DNA 的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定 [原理 ] 限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和 修饰现象中发现的。细菌内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用） 和 DNA 甲基化酶（修饰作用） 。它们对 DNA 底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。 Ⅱ型限制性内切酶，具有能够识别双链 DNA 分子上的特异核苷酸顺序的 能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断 DNA 的双链，形成一定长度和顺序 的 DNA 片段。限制性内切酶对环状质粒 DNA 有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数， 就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。 用已知相对分子质量的线状 DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出大分子形状相同的未知 DNA 的相对分子质量。 [试剂 ] 1. EcoR I 0.1mol/L  酶解反应液（ MgCl 2 。  10×） :  1mol/L pH7.5  Tris-HCl , 0.5mo