NENF基因对牛前体脂肪细胞和成肌细胞分化的作用研究.pdf

摘要 摘要 牛肉是世界上消费最广泛的肉类之一，近年来优质高档牛肉越来越受到广大消费 者的青睐，提高牛肉的产量和改善牛肉的品质已成为迫在眉睫的任务。牛肉的品质与 肌内脂肪含量密切相关，随着肌内脂肪含量的不断增加，夹杂于肌纤维之间的白色脂 肪组织越来越明显，就形成了大理石花纹牛肉。从细胞层面上说，在大理石纹牛肉中， 肌细胞与脂肪细胞夹杂分布，两种细胞可通过自分泌和旁分泌相互调控，最终影响牛 肉品质。因此，确定同时调控牛前体脂肪细胞和成肌细胞分化的关键基因对于深入揭 示肉牛脂肪-肌肉对话的分子机制及阐明大理石纹牛肉的形成至关重要。神经元衍生 神经营养因子（Neuron-derived neurotrophic factor, NENF ）是本实验室前期研究肉牛 肌肉和脂肪相互调控时，通过转录组测序技术和蛋白组学技术，在肌肉细胞-脂肪细 胞共培养体系中筛选出的一个差异表达蛋白质。目前，关于NENF 能否调节牛肌肉组 织的生长发育，以及是否参与脂肪-肌肉之间的对话，尚未见研究报道。因此，本研 究以NENF 基因为目标基因，通过小干扰RNA （Small interfering RNA, siRNA ）干扰 技术，从分子水平和细胞水平探讨NENF 基因对牛前体脂肪细胞及成肌细胞分化的调 控作用；此外，通过在牛前体脂肪细胞和成肌细胞共培养体系中外源添加NENF 重组 蛋白，研究其对两种细胞分化的影响，具体试验结果及结论如下： 1.时空表达规律研究结果显示：NENF基因在4 日龄新生犊牛和24月龄成年牛肌肉 组织中高丰度表达；在4 日龄新生犊牛脂肪组织中表达量偏低，24月龄成年牛脂肪组 织表达量处于中等水平；NENF基因在成年牛脂肪组织和肌肉组织中的表达水平显著 高于新生犊牛。 2.成功分离得到牛原代前体脂肪细胞和原代成肌细胞，且两种细胞体外培养、诱 导分化情况良好，具有较强分化潜能。随着牛前体脂肪细胞的分化，NENF基因整体 呈上升的趋势；随着牛成肌细胞的分化，NENF基因整体呈缓慢上升趋势。 3.在牛前体脂肪细胞中干扰NENF 基因的表达，牛前体脂肪细胞中脂滴积累明显 减少，分化受到抑制。qPCR 及Western Blot 分析显示，PPARγ 、CEBPα、CEBPβ、FASN 和SCD1 mRNA 水平显著下调，PPARγ 、CEBPα 和FASN 蛋白水平显著下调，但FABP4 的表达水平无显著变化。 4.在牛成肌细胞中干扰 NENF 基因的表达，牛成肌细胞中肌管的数量明显增多， 其分化得到明显的促进。qPCR 及WesternBlot 分析显示，MYOD1 、MYF5 、MYF6 、 MEF2A 、MEF2C 和CKM mRNA 水平显著上调，MYOD1 、MYF6 、MEF2A 和CKM 的蛋白水平显著上调，但MYOG 基因的表达未见明显变化。 I 西北农林科技大学硕士学位论文 5.成功建立了一种牛前体脂肪细胞和成肌细胞的共培养体系。筛选出NENF 重组 蛋白的最佳添加浓度为100 pg/mL 。在共培养体系添加NENF 重组蛋白后，牛前体脂 肪细胞中脂滴积累有所减少而牛成肌细胞的分化无明显变化。qPCR 结果显示，PPARγ 、 CEBPα、FABP4 、FASN 和SCD1 等基因的mRNA 水平在脂肪细胞中显著下调，MYOD1 、 MYOG 和MYH3 mRNA 水平在成肌细胞中无显著变化。 综上所述，NENF 能够促进单独培养条件下的牛前体脂肪细胞的分化和抑制牛成 肌细胞的分化，而在牛前体脂肪细胞和成肌细胞共培养体系中，外源添加的NENF重 组蛋白抑制了牛前体脂肪细胞的分化，对牛成肌细胞的分化无明显影响。这些结果表 明，在脂肪细胞与肌细胞共存的环境下，调控细胞分化的分子机制与单独培养的细胞 中存在差异。NENF是调控牛脂肪生成和肌生成的重要调控因子，参与牛脂肪-肌肉对 话，可作为肉牛肉质性状分子育种的重要候选基因。 关键词：牛；NENF ；前体脂肪细胞；成肌细胞；细胞分化 II