circRNA PRIM2对奶牛乳腺上皮细胞生物学功能及炎性应答的影响.pdf

摘要 摘要 奶牛乳腺炎是由物理、化学以及微生物感染等引起的乳腺组织炎症反应，其中最 常见的微生物是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。当这两种病原微生物侵入奶牛乳腺组织 时，分别以脂多糖（lipopolysaccharide ，LPS ）和脂磷壁酸（lipoteichoic acid ，LTA ） 作为主要毒力成分刺激乳腺组织产生不同程度的炎症反应甚至影响泌乳。环状 RNA （circular RNA ，circRNA ）是近年来广泛研究的非编码RNA ，是pre-mRNA 可变剪 切过程中产生的闭合环状RNA 分子，已有大量研究表明环状RNA 参与多种疾病进程 的调控，但circRNA 在奶牛乳腺炎中的相关作用研究甚少。 实验室在前期高通量测序结果中发现了一个circRNA ，其在病原菌诱导下的奶牛 乳腺上皮细胞的表达水平显著降低，由于其经 DNA 引物酶亚基 2 （DNA primase subunit 2 ，PRIM2 ）第8 和第9 外显子反式剪切形成，故将其命名为circRNA PRIM2 (circPRIM2) 。本研究在验证测序结果的基础上，分析了该环状RNA 的基本特性，并 通过在乳腺上皮细胞中过表达circPRIM2 ，探索了其对乳腺上皮细胞增殖与活力、酪 蛋白分泌以及炎性应答的影响及初步作用机制。 首先，建立了LPS 和LTA 体外诱导奶牛乳腺上皮细胞模型，通过实时荧光定量 聚合酶链式反应（Real time quantitive PCR ，RT-qPCR ）检测circPRIM2 的表达水平， 结果显示，在炎性诱导下，circPRIM2 在乳腺上皮细胞中的表达水平明显降低，与高 通量测序结果相一致。其次，采用RT-qPCR 检测奶牛的乳腺、心脏、肝脏、脾、胃、 肺、肾、肠等不同器官组织中circPRIM2 的表达量，结果显示，circPRIM2 在肺组织 中表达量较高，而在乳腺组织中基础表达水平较低。再次，为了探究circPRIM2 对奶 牛乳腺上皮细胞功能的影响，本试验建立了circPRIM2 稳定过表达的乳腺上皮细胞系， 采用酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA ）检测了β-酪蛋 白的分泌，结果显示，过表达circPRIM2 促进β-酪蛋白分泌；采用EdU 法和CCK-8 方法检测过表达circPRIM2 对奶牛乳腺上皮细胞的增殖和活力的影响，结果显示，过 表达 circPRIM2 抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖和活力；采用RT-qPCR 检测对其亲本 基因mRNA 水平的影响，发现过表达 circPRIM2 促进炎性乳腺上皮细胞中其亲本基 因的表达。最后，探究了circPRIM2 对乳腺上皮细胞炎性应答的影响及初步机制，采 用RT-qPCR 和ELISA 分别检测了乳腺上皮细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA 表达水平和蛋白分泌水平，结果显示过表达circPRIM2 抑制LPS 和LTA 诱 导的TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA 表达和蛋白的分泌，通过蛋白免疫印迹技术检测 NF-κB 信号通路关键信号分子磷酸化 P65 和总 P65 表达水平，结果显示，过表达 I 西北农林科技大学硕士学位论文 circPRIM2 通过抑制P65 的磷酸化抑制NF-κB 信号通路的激活。 综上所述，炎性状态下，circPRIM2 在乳腺上皮细胞中表达水平降低，过表达 circPRIM2 促进乳腺上皮细胞对β-酪蛋白的分泌，抑制乳腺上皮细胞增殖和活力，促 进 LPS 和 LTA 诱导的炎性乳腺上皮细胞中 circPRIM2 亲本基因的表达，通过调节 NF-κB 信号通路的激活来抑制乳腺上皮细胞的炎性应答。 关键词：奶牛；乳腺炎；环状RNA ；乳腺上皮细胞；泌乳；增殖；炎性应答 II 目录