C5a_C5aR信号在微小隐孢子虫感染中的作用研究.pdf

摘要 摘要 隐孢子虫病是由隐孢子虫（Cryptosporidium spp. ）感染引起的一种人兽共患原虫病， 严重威胁人和多种畜禽的健康和生命。目前，已在 100 多个国家的包括哺乳动物、鸟 类、爬行类和鱼类等 240 多种动物和人体内发现了隐孢子虫，造成了较为严重的经济 影响和社会效应。隐孢子虫感染可导致免疫缺陷畜禽和人、幼龄宿主和移植个体持续 性水样或致命性腹泻，健康动物或成年动物虽为无或轻微感染，表现一过性、自限性腹 泻，但可成为潜在的传染源。鉴于隐孢子虫的宿主广泛性和严重危害，国内外学者在病 原生物学、致病特征、疫苗和药物方面做了大量工作，然而，还没有开发出有效的预防 性措施和药物防控隐孢子虫病。前人研究发现，宿主抵御隐孢子虫感染主要依靠细胞 + 免疫，尤其是 CD4 T 细胞，同时研究发现补体裂解片段 C5a 通过与其受体 C5aR 结合 + 调节 CD4 T 细胞的分化和效应，参与抗感染免疫反应。但是，C5a/C5aR 信号在隐孢 子虫感染中的作用尚不清楚。基于此，本研究以人兽共患微小隐孢子虫（C. parvum） 为研究对象，以 C. parvum 感染 BALB/c 乳鼠为模型，研究了 C5a/C5aR 信号在 C. parvum + 感染中对宿主 CD4 T 细胞亚群主效应细胞因子和转录因子的调节作用，获得了以下结 果： 7 1. 建立了 C. parvum 感染 BALB/c 乳鼠模型：将 1×10 个 C. parvum 卵囊脱囊后经 口感染 5 d 的BALB/c 乳鼠，在感染后 （post infection ，pi ）6 h、12 h、24 h 、36 h、48 h 、3 d、4 d 、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、15 d、20 d 、25 d 和 30 d 采集回肠组织， 利用基于隐孢子虫 HSP70 基因的 Real-time PCR 进行感染情况检测，利用 HE 染色进 行组织病理学观察，利用抗酸染色法检测大肠内容物中的卵囊。研究发现，在 6 hpi 即 可检测到 HSP70 基因的表达，直至 25 dpi ，高峰在 7 dpi ；在 5 dpi 和 7 dpi ，可见感染 乳鼠回肠绒毛寄生有隐孢子虫，回肠绒毛脱落、萎缩，回肠末端黏膜结构完整性破坏、 细胞间隙明显变宽，有中性粒细胞及炎性细胞浸润；在 7 dpi 的乳鼠大肠内容物中可发 现大量玫瑰红色或暗红色 C. parvum 卵囊。 2. C. parvum 感染引起 BALB/c 乳鼠回肠组织 C5a 和 C5aR 的 mRNA 显著上调表 达：在 C. parvum 感染后采集乳鼠回肠组织，利用 Real-time PCR 测定了回肠组织的C5a 和 C5aR mRNA 的表达水平，发现 C5a 在 3 dpi 、4 dpi 、20 dpi 和 30 dpi 显著升高；C5aR 在 12 hpi 、36 hpi 、4 dpi 、5 dpi 、7 dpi 、15 dpi 和 30 dpi 显著高于对照组，并在 5 dpi 达 到高峰。 3. C. parvum 感染诱发了 BALB/c 乳鼠回肠组织中 Th1 型免疫效应：利用 Real-time + PCR 测定和分析感染乳鼠回肠组织中 CD4 T 细胞亚群 Th1、Th2、Th17 和 Treg 主效 I 西北农林科技大学硕士学位论文 应细胞因子及其相应的转录因子的相对表达情况发现，Th1 细胞主效应因子 IFN-γ 在 2 dpi、4 dpi 、5 dpi 、6 dpi 、7 dpi 、9 dpi 、10 dpi 、20 dpi 、25 dpi 和 30 dpi 显著上调表达， 在 6 dpi 达到高峰，其转录因子 T-bet 也在 3 dpi 、7 dpi 、10 dpi 、20 dpi 和 30 dpi 显著上 调表达；Th2 细胞主效应因子 IL-4 及其转录因子 GAT