TP53INP2基因对秦川肉牛脂肪细胞分化调控机制的研究.pdf

摘要 摘要 脂肪组织是哺乳动物的生长发育过程中非常重要的内分泌器官，有着调控能量代 谢和脂质合成分解的作用。另外，牛肉的风味和嫩度与肌内脂肪含量密切相关，而肌 内脂肪的含量在分子水平受脂肪细胞增殖与分化的影响。肿瘤蛋白 p53 诱导核蛋白 2 （TP53INP2 ）是转录和自噬的双重调控因子，已有的研究表明TP53INP2 基因负调控 人和小鼠前体脂肪细胞的分化。但关于TP53INP2 能否通过自噬影响牛脂肪细胞分化的 分子机制尚未被阐明。本研究以秦川牛肉用新品系（简称“秦川肉牛”）为研究对象， 较为系统的探究了TP53INP2 基因对于牛脂肪细胞分化的调控机制。首先，本研究成功 分离了新生牛的前体脂肪细胞，通过构建过表达载体以及合成小干扰RNA ，并在分化 的不同天数转染牛前体脂肪细胞，在分子和细胞水平探究了TP53INP2 基因是否影响以 及如何影响秦川肉牛前体脂肪细胞的分化，取得试验结果如下： 1.TP53INP2 基因在秦川肉牛的肌肉组织中高丰度表达 （p 0.01 ），在秦川肉牛的皮 下脂肪组织有所表达，RT-qPCR 结果显示，TP53INP2 基因的mRNA 表达量在诱导分 化后的第二天达到峰值 （p 0.01 ），随后表达量有所下调，预示着该基因可能参与牛前 体脂肪细胞的早期分化。 2.PCR 扩增牛TP53INP2 基因CDS ，得到CDS 区全长675bp；成功构建了pcDNA3.1 （+ ）-TP53INP2 过表达载体，24h 、48h 、72h 及 150h 的过表达效率分别约为400 倍、 500 倍、35 倍及14 倍，且均达到极显著高于对照组水平（p 0.01 ）；在合成的3 条siRNA 中筛选到一条干扰效率最佳的siRNA，24h 、48h 、72h 及150h 的干扰效率分别约为84%、 83%、70%及40%倍，且均达到极显著高于对照组水平 （p 0.01 ）。 3.干扰TP53INP2 基因的表达能显著抑制脂肪细胞分化过程中脂滴的形成，并能抑 制成脂分化标志基因PPARγ 、PLIN2 、FASN 蛋白和mRNA 水平的表达 （p 0.05 ）；相 反，过表达TP53INP2 基因则促进脂肪细胞分化过程中脂滴的形成并促进成脂分化标志 基因在分化过程中的表达 （p 0.05 ）。表明TP53INP2 基因正调控牛前体脂肪细胞的分 化。 4.敲低TP53INP2 基因能显著抑制脂肪细胞早期分化过程中自噬的程度，并能显著 抑制自噬标志性基因ATG7 、BECN1 的mRNA 表达量以及LC3 、p62 蛋白水平的表达 量 （p 0.05 ）；相反，过表达该基因能促进脂肪细胞早期分化过程中自噬的发生及自噬 标志蛋白的表达。揭示TP53INP2 基因促进早期分化过程中自噬的发生并可能通过自噬 调控牛前体脂肪细胞分化 （p 0.05 ）。 5.过表达及干扰TP53INP2 基因时，分化标志基因PPARγ 的mRNA 及蛋白表达水 I 西北农林科技大学硕士学位论文 平都显著的升高或降低 （p 0.05 ）。PPARγ 激动剂罗格列酮体外挽救试验结果表明：罗 格列酮能显著缓解干扰 TP53INP2 基因所引起的脂滴减少及成脂分化标志性基因表达 量下调的现象 （p 0.05 ）。结果表明，TP53INP2 基因可能通过PPARγ 通路影响牛前体 脂肪细胞分化。 综上，该研究表明，TP53INP2 基因能激活脂肪细胞早期分化过程中自噬的发生， 并通过自噬调节秦川肉牛脂肪细胞分化；另外，TP53INP2 基因也可能通过 PPARγ 通 路调控秦川肉牛脂肪细胞分化。 关键词：秦川肉牛；TP53INP2 ；自噬；脂肪细胞分化；PPARγ II 目录 目录 摘要I ABSTRACT III 第一章 文献综述 1 1.1 脂肪组织功能与脂肪细