减数分裂关键基因SPO11-1在西瓜中的初步功能研究.pdf

摘 要 摘 要 西瓜 （Citrullus lanatus ）是一种广泛栽培的园艺作物，大多为雌雄异花同株，具有 很高的经济价值和营养价值。减数分裂作为有性生殖的主要过程，在减数分裂过程中 由于非姐妹染色单体之间发生了交换，不仅增强了物种的遗传多样性，也为创制新的 种质资源提供了更多的原材料，对西瓜的生殖发育至关重要。SPO11- 1 蛋白与拓扑异 构酶VIA 同源，能够起始减数分裂重组过程的发生。已有相关报道指出在拟南芥、水 稻、玉米等植物中发现了SPO11-1 的同源基因，它的突变会导致重组过程缺陷进而导 致不育。本研究以拟南芥AtSPO11-1 基因的氨基酸序列在西瓜全基因组数据库中进行 序列比对得到西瓜同源基因（ID ：Cla003301 ），命名为ClSPO11-1。克隆得到该基因后， 通过农杆菌介导的转化方法对洋葱表皮进行瞬时转化表达。利用CRISPR/Cas9 技术对 目的基因进行敲除。通过酵母双杂交系统在西瓜混合cDNA 文库中筛选ClSPO11- 1 的 互作蛋白。获得以下主要研究结果： 1. 从西瓜“97103 ”全基因组数据库BLAST 得到ClSPO11-1 的基因和氨基酸序列， 利用基因组网站得到的序列设计引物，从西瓜“YL ”基因组DNA 中克隆得到目的基 因全长为3430bp ，通过5’RACE PCR 技术从“YL ”花蕾中扩增得到目的基因的cDNA 全长为1095bp ，编码364 个氨基酸，包含有15 个外显子，14 个内含子。 2. 进化树分析表明ClSPO11-1 在进化关系上与拟南芥较近，ClSPO11- 1 蛋白包含 TOPRIM_Topo6A/Spo11 保守结构域，属于拓扑异构酶基因家族成员，该蛋白属于疏水 性蛋白，分子量为42.10 kDa ，等电点为8.73。 3. 组织表达模式分析结果发现ClSPO11-1 基因在西瓜各个不同组织中均有表达， 在花蕾（1.6- 1.8mm ）处于减数分裂偶线期时表达量最高；将构建好的 pCAMBIA1300 -ClSPO11-1-GFP 重组质粒导入农杆菌GV3101 （pSoup-p19 ）细胞，并进 一步进行洋葱表皮细胞的瞬时转化检测 ClSPO11- 1 亚细胞定位，结果显示该蛋白定位 于细胞核内。 4. 将构建成功的ClSPO11-1 基因19nt 双靶位CRISPR/Cas9 基因编辑载体导入发根 农杆菌Ar.Qual 中，侵染西瓜子叶外植体，待其长出不定根后提取根系DNA ，对靶位 点进行PCR 扩增，测序结果表明本试验其中1 个靶位点出现被编辑现象，此结果表明 该基因编辑载体可用于西瓜的稳定转化。 5.，将上述构建且检测成功的 ClSPO11-1 基因编辑载体稳定遗传转化西瓜，通过 植物组织培养技术获得5 株抗性植株，提取叶片的基因组DNA ，进行PCR 扩增检测， 测序结果表明其中有2 株植株在靶位点 1 处出现了不同程度的编辑现象。进一步对其 I 西北农林科技大学硕士学位论文 氨基酸序列进行分析，结果表明 2 株抗性植株分别出现了氨基酸不同程度的变异或者 翻译提前终止。 6. 构建ClSPO11-1 基因的酵母双杂交诱饵载体，将验证正确的酵母诱饵重组质粒 pGBKT7-SPO11 和pGBKT7 空载体进行酵母菌株Y2HGold 的转化，结果表明诱饵蛋白 pGBKT7-SPO11 无毒性和自激活作用。 7. 利用西瓜的混合cDNA 文库，通过酵母双杂交系统筛选与ClSPO11- 1 互作的蛋 白。对筛选到的4 个阳性克隆提取质粒并转化大肠杆菌感受态，PCR 检测测序结果表 明初步筛选获得4 个单一序列，并在西瓜全基因组数据库中进行比对和注释。 8.为了排除假阳性现象，通过酵母双杂交实验点对点检验 ClSPO11- 1 与4 个候选 互作蛋白之间的相互作用，结果发现ClSPO11- 1 与其中的Cla014788 和Cla008661 两 个蛋白发生互作，其编码的蛋白分别为激酶、酪氨酸磷酸酶。分析 Cla014788 和 Cla008661 基