T CVMA 28-2020 猪瘟病毒微滴式数字RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 团 体 标 准 T/CVMA 28-2020 猪瘟病毒微滴式数字RT-PCR 检测方法 Method of droplet d igital RT-PCR for detection of c lassical swine fever v irus 202-12-22 发布 2020-12-22 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 T/CVMA 28-2020 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：中国动物疫病预防控制中心、辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省葫芦岛市建 昌县现代农业发展服务中心。 本文件主要起草人：董浩、王传彬、杨林、宋晓晖、原霖、李硕、韩焘、毕一鸣、陈亚娜、陈瑶、 赵妍、郑文峰、于广秋。 I T/CVMA 28-2020 猪瘟病毒微滴式数字RT-PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了猪瘟病毒 （classical swine fever virus ，CSFV ）微滴式数字RT-PCR检测方法的原理、 试剂与耗材、仪器与设备、操作步骤、结果分析。 本文件适用于猪的脏器、血液、排泄物和细胞培养物中猪瘟病毒野毒株和疫苗株核酸的精准定量检 测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 微滴式数字PCR （droplet digital PCR，ddPCR ）的技术原理是利用微滴化技术将一份反应体系分成 数万个纳升级的微滴进行定量PCR检测，本质上是将传统定量PCR 的一次检测变成数万次检测，提高了 检测的灵敏度和精准度。微滴发生器可以将每一份扩增体系分成数万个均匀的纳升级微滴，每个微滴不 含或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都将作为一个独立的PCR扩增体系，在PCR扩增仪上 进行终点PCR扩增。利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光 信号的微滴判读为0 。然后根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。 5 试剂与耗材 5.1 提取试剂 宜选取商品化的病毒RNA 提取试剂盒，或选用其他等效提取核酸方法。 5.2 微滴式数字RT-PCR 扩增试剂 宜按照不同的微滴式数字PCR 平台的说明书选取推荐的微滴式数字PCR 扩增试剂。 5.3 引物和探针 1 T/CVMA 28-2020 CSFV 上游引物 （CSFVF ）