T CVMA 40-2020 乙型脑炎病毒微滴式数字RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 团 体 标 准 T/CVMA 40-2020 乙型脑炎病毒微滴式数字RT-PCR 检测方 法 Method of droplet d igital RT-PCR for detection of Japanese encephalitis v irus 2020-12-22 发布 2020-12-22 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 T/CVMA 40-2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：上海市动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：李鑫、王建、赵洪进、鞠厚斌、葛菲菲、杨德全、沈海潇、杨显超、刘健、陶 田谷晟。 1 T/CVMA 40-2020 乙型脑炎病毒微滴式数字RT-PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了乙型脑炎病毒 （Japanese Encephalitis Virus ，JEV ）微滴式数字RT-PCR检测的操作方 法。 本文件适用于猪脑组织、血液样本中乙型脑炎病毒感染及疫苗免疫核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 数字RT-PCR ： 数字反转录聚合酶链式反应（digital reverse transcript polymerase chain reaction ） BHQ1 ： 无荧光淬灭基团（black hole quencher-1） FAM ： 6-羧基荧光素 （6-carboxyfluorescein ） RNA ： 核糖核酸 （ribonucleic acid ） 5 原理 微滴式数字PCR （Droplet Digital PCR ，ddPCR ）的技术原理是利用微滴化技术将一份反应体系分成 数万个纳升级的微滴进行定量PCR检测，本质上是将传统定量PCR 的一次检测变成数万次检测，提高了 检测的灵敏度和精准度。微滴发生器可以将每一份扩增体系分成数万个均匀的纳升级微滴，每个微滴不 含或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都将作为一个独立的PCR扩增体系，在PCR扩增仪上 进行终点PCR扩增。利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光 信号的微滴判读为0 。然后根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。 本文件通过特异性引物和探针进行数字RT-PCR扩增，从而对乙型脑炎病毒核酸进行检测。 6 试剂与材料 6.1 引物和探针 上游引物 （JEV F ）： 5 ＇- ACCAAGAAGTCTACGTCCAATATGG -3 ＇ 下游引物