K210 食品微生物检验技术、K209 农产品微生物检验技术 W4403单增李斯特氏菌检验—检验操作程序及要点、W4403单增李斯特氏菌检验—检验操作程序及要点 W4403单增李斯特氏菌检验—检验操作程序及要点-4-微教材.docx

农产品与食品质量检测技术教学资源库 PAGE \* Arabic 3 / NUMPAGES \* Arabic 5 《农产品/食品质量安全检测技术》课程-微教材 微课编号 W4403 微课名称 单增李斯特氏菌检验—检验操作程序及要点 所属模块 农产品/食品中微生物致病菌检验 子模块 M4-4 单增李斯特氏菌检验 关键词 致病菌；检验；单增李斯特氏菌；检验操作程序；要点 是否通用 √通用 农产品 食品 是否重点建设 √是 否 微课类型 实验实训型 微课形式 混合拍摄式 微课类型 实验实训型 教学目标 掌握标准中单增李斯特氏菌的检验基本流程，掌握增菌、分离、初筛、鉴定4个检验操作的基本操作要点。 教学内容 知识点 技能点 1、单增李斯特氏菌的增菌 2、单增李斯特氏菌的分离 3、单增李斯特氏菌的初筛 4、单增李斯特氏菌的鉴定 知识讲解 增菌 在无菌室内，以75%酒精擦拭样品外包装，尤其是包装的开口处，用无菌剪刀在样品封口处剪开包装袋，取出内包装袋，换用一个无菌剪刀和镊子将肉松样品剪碎至无菌罐内，用无菌镊子称取25 g样品至盛有225 mL LB1增菌液中，再转入注明样品信息、检测人员以及检测日期的均质袋中，密封，用拍击式均质器拍击2 min。操作完毕后清理无菌室，物品通过传递窗出无菌室，打开无菌室紫外灯，辐照灭菌30 min。 ②将上述均质完成的检测样品放于预先设置30 ℃的恒温恒湿培养箱中培养24 h。 二、二次增菌 （1）BSL-2实验室消毒与准备 病原微生物分离鉴定工作应在BSL-2实验室中进行，BSL-2实验室的消毒与准备如下： ①进入BSL-2实验室缓冲间，做好个人防护，将增菌所用无菌试剂放入BSL-2缓冲间的传递窗中，打开传递窗紫外灯进行表面杀菌。 ②进入已进行整体消毒过的BSL-2实验室，用75%酒精棉擦拭生物安全柜台面，依次开启生物安全柜和BSL-2实验室的紫外灯，辐照灭菌1小时后关闭。 ③进入BSL-2实验室缓冲间，更换防渗透防护衣，戴一次性帽子、口罩和无菌手套，穿上鞋套，取出传递窗内的物品，放在工作台面上。进行后续操作。操作时避免双臂频繁穿过气幕破坏气流。 （2）二次增菌 ①将培养物移入BSL-2实验室生物安全柜内，于200ml LB2基础增菌液无菌加入吖啶黄素和萘啶酮酸各1支, 每10ml分装试管，制成LB2增菌液。轻轻摇动培养后的LB1增菌液，移取0.1 mL转种于 10 mL LB2 增菌液内，充分振荡。为防止漏检，本实验接种2支LB2 增菌液试管，物品通过传递窗出BSL-2实验室，清理BSL-2实验室与生物安全柜，分别打开紫外灯，辐照灭菌60 min。 ②接种后的LB2 增菌液试管于 30 ℃培养箱培养18 h～24 h。 下述步骤均在BSL-2实验室里的生物安全柜内进行。 三、分离 在BSL-2实验室生物安全柜内，取培养后的LB2二次增菌液分别划线接种于PALCAM琼脂平板和单增李斯特菌显色培养基平板各2块，置于36oC培养箱培养24h-48h，待观察。 本实验各平板上的菌落特征如下： PALCAM琼脂平板典型菌落特征为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。 单增李斯特菌显色培养基典型菌落特征按照产品说明进行判定。本实验采用法国科玛嘉显色平板，单增李斯特在该培养基上菌落为规则蓝色菌落，带有白色晕环（直径小于3mm）。 四、纯化 在BSL-2实验室，从选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落， TSA-YE琼脂平板上划线纯化，于30℃培养18h-24h，待观察。 {呈现菌落培养的特写镜头} 五、鉴定： （1）染色镜检 取洁净载玻片，于其上滴加1滴生理盐水，用接种环将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察菌体形态。单增李斯特菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（（0.4μm～0.5μm）×（0.5μm～2.0μm）。 （2）动力试验 从TSA-YE纯化平板上挑取单菌落接种于半固体动力培养基，于30℃培养24 h～48 h，观察结果。 本实验菌体呈伞状生长或月牙状生长，有动力。 （3）过氧化氢酶试验 用一次性接种针挑取纯培养的单菌落，接种于1支3 %过氧化氢试剂中，观察结果。于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。 本实验结果显示，迅速产生气泡，过氧化氢酶试验为阳性。 （4）生化鉴定 经过以上菌落特征观察、染色镜检、动力试验和过氧化氢酶试验，选择3～5个纯培养的符合单增李斯特氏菌特征的可疑菌落继续做生化鉴定试验。 生化鉴定分为传统生化鉴定和系统生化鉴定。传统生化鉴定需在从选择性分离平板上挑取可疑菌落进行纯化时，接种木糖和鼠李糖进行初筛，选择木糖阴性和鼠李糖阳性的菌落