K208 食品质量安全检测技术 W5404 HPLC-UV检测糖果中色素的含量 W5404HPLC-UV检测糖果中色素的含量-4-微教材.docx

农产品与食品质量检测技术教学资源库 PAGE \* Arabic 1 / NUMPAGES \* Arabic 8 《农产品/食品质量安全检测技术》课程-微教材 微课编号 W5404 微课名称 HPLC-UV检测糖果中色素的含量 所属模块（章节） 添加剂含量检测 子模块 色素的检测 关键词 高效液相色谱，紫外检测器，合成色素 是否通用 通用 农产品 √食品 是否重点建设 √是 否 微课类型 实验实训型 微课形式 混合拍摄式 教学设计模式 任务驱动法 教学目标 了解紫外检测器的结构及工作原理； 掌握高效液相色谱操作步骤 教学内容 知识点 技能点 高效液相色谱仪器结构组成； 2、紫外检测器的结构与工作原理 高效液相色谱规范操作步骤 2、高效液相色谱使用注意事项 知识讲解 食品着色剂最常用检测技术是色谱技术，其中高效液相色谱由于分离效能高、分析速度快及应用范围广等特点，被广泛应用于食品着色剂的检测中。今天我们将来学习下高效液相色谱紫外检测法对糖果中日落黄、亮蓝含量的检测。依据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1743-2006。 高效液相色谱检测器 高效液相色谱法（HPLC）是基于流动相中各组分与固定相发生作用的强弱不同以及固定相中滞留时间不同进行分离分析的方法。仪器通常由储液瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统等构成。高压输液泵将储液瓶中的流动相以稳定流速输送至分析体系中，样品从进样器中进入，随流动相进入色谱柱中，在色谱柱中各组分被分离，并按先后顺序进入检测器，记录仪将进入检测器的信号记录下来，得到液相色谱图。 （一）检测器定义与分类 检测器是高效液相色谱的重要部件，是用来检测经色谱柱分离后的流出物组成和含量变化的装置。常见检测器有紫外光度检测器、荧光检测器、电化学检测、化学发光检测器、示差折光检测器等。其中紫外检测器是HPLC应用最广的检测器，其工作原理是基于朗伯-比尔定律，可以对那些在紫外、可见光波长下有吸收的物质进行测定。 （二）紫外检测器工作流程 其工作流程是光源（氘灯，波长在190-600nm连续可调）发射的光经过聚光透镜聚焦，由可旋转组合滤光片滤去杂散光，再通过入射狭缝至平面反射镜M1，经反射后到达光栅，光栅将光衍射色散成不同波长的单色光。当某一波长的单色光经平面反射镜M2反射至光分束器时，透过光分束器的光通过样品流通池，最终达到检测样品的测量光电二极管。被光分束器反射到达检测基线波动的参比光电二极管。比较二者可获得测量和参比光电二极管的信号差，此即为样品的检测信息-吸光度。 （三）紫外检测器优点 紫外检测器具有灵敏度高（最小检出量可达到ng数量级）、噪声低、线性范围宽、应用广泛，对流动相的流速和温度变化不敏感，适用于梯度洗脱，结构简单，使用维修方便，能与其他检测器串联等优点。采用紫外检测器的HPLC可同时检测人工合成色素柠檬黄、苋菜红、胭脂红及日落黄等。在不同时间段可分别用各组分的最佳检测波长进行检测，此法不仅灵敏度高，还能克服梯度洗脱时的基线漂移，减少共存物的干扰。 边学边练 下面，我们示范用HPLC-UV检测糖果中日落黄和亮蓝的含量 操作要点： 1、放置流动相。将甲醇、乙酸氨溶液分别放到流动相A、B的试剂瓶中， 注意（1）高效液相色谱的流动相应采用色谱纯溶剂，以满足仪器要求、避免损坏色谱柱。 （2）流动相需经过滤、除气后方可使用。 2、开机。依次打开高压泵、自动进样器、柱温箱、检测器、控制器、计算机电源开关。 3、联机。打开软件，进入仪器工作站，进行联机。 4、检查。依次检查高压泵接头、进样阀、色谱柱等位置是否漏液，柱压是否正常。 5、排气：打开废液保护阀，按PURGE键，在操作软件点击“排气”选项，将高压输液泵和稳压泵中的气泡赶尽，排气结束后关闭废液保护阀。 需注意，不能在废液保护阀关闭的情况下进行排气，否则高流量的流动相和高的柱压会直接将色谱分离柱损坏。 6、冲洗流路。首先用甲醇冲洗流路20分钟，再用流动相冲洗30分钟，采集基线，待基线走平30分钟后，方可进样。 7、放置样品：将5个标准品和3个待测样品依次放置到自动进样盘中。注意待分析的样品必须彻底溶解澄清、过滤，以避免堵塞、损坏色谱柱。 8、新建方法。 点击新建方法，在仪器参数设置中，依次填写实验参数： 色谱柱：InertSustain C18（5μm×4.6mm×250mm） 流动相：甲醇：乙酸铵溶液(5：95)（pH=4，0.02mol/L） 梯度洗脱 时间 甲醇 乙酸铵 0min 20% 80% 5min 35% 65% 12min 98% 2% 19min 20% 80% 流速：1mL/min。 进样量