蛋白酶活力测定ppt演示课件.ppt

（3）硼砂—氢氧化纳缓冲溶液 pH=10 A液：0.055mol/L Na2B4O7 · 8 H2O 19g Na2B4O7 · 8 H2O 1000ml B液：0.2 mol/L NaOH 8g NaOH 1000ml A液50ml B液43ml H2O 200ml 硼砂—氢氧化纳缓冲溶液的pH计算 弱酸—弱酸盐缓冲体系 Na2B4O7 + 7H2O ═ NaOH + 4H3BO3 H3BO3 + H2O ═ B(OH)4- + H+ 一元弱酸Ka=5.6×10-10 pH=pka1-lg（C酸/C盐） =9.24- lg（C酸/C盐） 四、操作手续 （一）制作标准曲线 1．配制100μg/ml酪氨酸标准溶液 2．配制系列浓度的酪氨酸标准溶液 3. 与福林试剂反应显色，测OD值 4. 绘制标准曲线 （二）测定蛋白酶活力——实测 1．缓冲溶液的配制 2．底物配制 3．待测酶液配制 4．测定 （一）制作标准曲线 1．配制100μg/mL酪氨酸标准溶液 0.1000g酪氨酸 0.1mol/LHCL 100ml容量瓶 1mg/ml=1000μg/ml 再移取10ml 0.1mol/LHCL 100ml容量瓶 0.1mg/ml=100μg/ml 思考题 为什么酪氨酸要干燥至恒重？ 为什么酪氨酸要称准至0.1000g？ 为什么酪氨酸用盐酸溶解？ 为什么要先配成1000ug/ml，再配成100ug/ml？ 2．配制系列浓度的酪氨酸标准溶液 3．系列浓度的酪氨酸显色并测OD值 酪氨酸标准溶液1ml 摇匀 10分钟 蓝色 冷却 1cm比色皿 680nm波长 5ml0.55mol/L Na2CO3 40℃水浴 0号调零，测OD值 福林试剂1ml 说明 （1）各试剂均用刻度移液管移取 （2）显色后需冷却到室温 （3）每一点测两份，ΔOD≤0.01 共3×6＝18支干试管 4．数据处理 （1）画图求直线斜率的倒数K （2）计算K （3）直接查取 （4）计算机处理，回归曲线：C=K.OD 蛋白酶活力测定 一、概述 二、测定原理 三、试剂 四、操作手续 五、计算 六、注意事项 一、概述 1．什么是酶？ 2．影响酶催化反应的因素 3．什么是酶的活力? 4．测定意义 5. 测定方法 生物催化剂 特殊催化功能的蛋白质 酶的特性: （1）作用有专一性、选择性 （2）催化速度快 （3）反应条件温和 （4）化学本质是蛋白质 一种酶只作用一种底物： 淀粉酶：只能催化淀粉水解 → 糊精、低聚糖； 蛋白酶：只能催化蛋白质水解 → 氨基酸、肽； 在激烈振荡、加热、紫外线、X-射线的照射，重金属盐作用下，它的二、三结构会发生改变。而变性，失去催化能力这种现象叫做酶的失活 底物浓度 pH 温度 时间 V Vmax 底物浓度C C0 饱和浓度 底物浓度 OD pH pH最适 溶液pH的影响 酶的分类 酸性蛋白酶 3350 pH最适=2～4； 7401 pH最适=3.0 中性蛋白酶 1398 pH最适=7～7.5； 166