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第四章  酶分子修饰   ; 前言： 酶分子经过修饰以后，可以显著提高酶的使用范围和应用价值。 酶分子修饰成为酶工程中具有重要意义和应用前景的领域。 本章主要介绍酶分子修饰的基本原理、方法与修饰酶的特征。;酶工程;;酶的化学修饰;一、酶分子修饰的概念 通过各种方法使酶分子结构发生改变，从而改变酶的某些性质和功能的过程，称为酶分子修饰。 ; 二、酶分子修饰的原理 酶分子是具有完整的化学结构和空间结构的生物大分子，酶分子的完整结构决定了酶的性质（催化效率高，专一性强和作用条件温和等）和生物催化功能。当酶分子的结构发生改变时，将会引起酶的性质和功能的改变。;三、酶分子修饰的目的 ①提高酶的活性； ②增强酶的稳定性； ③降低或消除酶的抗原性； ④探讨酶结构与功能之间关系。;第二节 酶分子修饰的方法;一、金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。 ; 金属酶：即含有金属离子的酶，金属离子在酶中主要有结构功能和催化功能。金属酶种类繁多，如：Fe、Zn、Cu、Mn、Mo、Co、Ni等。金属离子在相应的金属蛋白中有一定数目的原子参与活性，金属与邻近的非金属原子（S、O、N等）配位一起构成辅基，并与蛋白结合发挥出独特的催化功能，估计在全部已知的酶中大约1/4～1/3都要求具备金属离子的活性中心。;（一）、金属离子置换修饰的方法 ⑴酶的分离纯化：首先获得一定纯度的酶。 ⑵除去原有的金属离子：利用螯合剂（EDTA等）与金属离子形成螯合物，再通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将螯合物除去。 ⑶加入置换离子：加入另一种金属离子。常用 的金属离子一般为：Ca2＋、Mg2＋、Mn2＋、Zn2＋、Co2＋、Cu2＋、Fe2???等二价金属离子。 ;（二）、金属离子置换修饰的作用 1、阐明金属离子对酶催化作用的影响 2、提高酶的活力 例如：α－淀粉酶，是杂离子型的。将其他的杂离子换成钙离子，则可以提高酶活力并显著增强酶的稳定性。结晶的钙型α－淀粉酶的活力比一般结晶的杂离子型α－淀粉酶的活力提高3倍以上，而且稳定性大大增加。;3、增强酶的稳定性 例如：Fe－SOD分子中的铁离子被锰离子置换，成为Mn－SOD后，其对过氧化氢的稳定性显著增强。对叠氮钠（NaN3）的敏感性显著降低。 4、改变酶的动力学特性 例如：用钴离子置换酰基化氨基酸水解酶的活性中心的锌离子，其催化N－氯－乙酰丙氨酸水解的最适pH值从8.5降低为7.0。同时该酶对N－氯－乙酰丙氨酸的米氏常数Km增大，亲和力降低。 ;二、大分子结合修饰 采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰。 目前应用最为广泛的酶分子修饰方法。 （一）、大分子结合修饰的方法 1、修饰剂的选择 一般为水溶性大分子。如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖苷、蔗糖聚合物（ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。 相对分子质量为1000～10000的PEG被广泛应用。;2、修饰剂的活化 聚乙二醇修饰蛋白质主要通过聚乙二醇的末端羟基与蛋白质的氨基酸残基反应而实现，但聚乙二醇的末端羟基活性很差，很难在温和的环境中与蛋白质进行偶联反应，所以必须使用活化剂活化该羟基，使活化的聚乙二醇能在温和的环境中对蛋白质进行共价修饰。 近年来聚乙二醇的活化方法已成为该领域的研究热点之一。 ; 例如，常用的大分子修饰剂单甲氧基聚乙二醇（MPEG）可以采用多种不同的试剂制备聚乙二醇衍生物： ①聚乙