WB实验基本原理.PDF

北京百奥莱博科技有限公司 ================================= WB 实验基本原理 免疫印迹检测法（Western blotting ）,又称蛋白质印迹，是分子生物学、生物化学和 免疫遗传学等生命科学研究中常用的的一种实验方法，其基本原理是通过 SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳区分待测样品不同的组分，再在电流的作用下，使蛋白质从凝胶转移至固相载体（膜） 上，通过特异性抗体作为探针，对靶抗原蛋白质进行检测，通过分析特异性反应的位置和强 度获得特定蛋白质在所分析的细胞或（和）组织中表达情况的信息。 一、 基本原理 Western blotting 实验通常由 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质的印迹和检测两个部 分组成。 第一部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 蛋白质的电泳分离是指带电粒子在电场作用下,向着与其所带电荷相反的电极移动 的现象，各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。聚丙烯酰 胺凝胶 （PAG ）是由丙烯酰胺单体（Acr ）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（Bis ）在催化剂过硫 酸铵作用下聚合交联而成的三维网状结构凝胶。如果在电泳体系中加入十二烷基硫酸钠 （SDS ），则电泳迁移率主要依赖于分子量，与所带的净电荷和形状无关。这种电泳方法称 为 SDS，主要用于测定蛋白质亚基分子量。 2. 电泳启动后，蛋白样品先在浓缩胶中运动，由于浓缩胶孔径大，蛋白质运动受阻小， 因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上层，全部蛋白质处于同一起跑线上。当蛋白质进入分 离胶时，因单位质量带负电荷多者迁移快，反之则慢，即分子量小的蛋白迁移快，分子量大 的蛋白迁移慢；由于分离胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大， 小分子阻力小，因而蛋白质在电泳过程中最终达到彼此分开。 3. 由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过的可移动样品蛋白质的分子量也不同。 选择一定的凝胶浓度，即选择合适的凝胶孔径，可使待分离样品蛋白质的泳动速率差异最大， 得到最佳分离效果。通常根据被分离蛋白质的分子量范围选择凝胶浓度。 凝胶浓度与蛋白质分子量测定的关系 蛋白质分子量范围(KD) 凝胶浓度(%) 10 15 10-30 12 30-100 10 100-500 8 电话：010址：邮箱：refers@163.com 北京百奥莱博科技有限公司 ================================= 500 5 第二部分：蛋白质的印迹和检测 蛋白质的印迹和检测包括五个步骤： 转膜→封闭→孵育一抗→孵育二抗→蛋白检测（显色）和分析 1. 转膜 蛋白质印迹首先是要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（膜）上 ，即转膜。 最常用的固相载体（膜）主要是硝酸纤维素（NC ）膜和聚偏二氟乙烯（PVDF ）膜。硝酸 纤维素（NC ）膜与蛋白质之间靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小； 非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便 ；但结合在NC 上的小分子蛋白质在洗涤时易丢 失；NC韧性较差，易损坏。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随 着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45 μm 和0.2 μm 两 种规格的NC 膜 ，大于20 KD 的蛋白可用0.45 μm 的膜，小于20 KD 的蛋白就要用0.2 μ m 的膜。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜与蛋白质亲和力高，用前需在甲