8-第4章-2 全基因组测序.pdf

第4章-2 全基因组测序 全基因组 将基因组DNA随机断裂后克隆，随后 根据载体插入位点序列设计通用引物 鸟枪法测序 自动化两端测序。两端序列为读序， 可输入计算机拼接为重叠群(Contig). DNA 序列 组装 后 质量 判断 基因组DNA随机克隆后，采取克隆DNA两端测序。获得的测序称为读序 (reads），可以根据序列的重叠依次排序组成重叠群 （Contig）。这些 Contig的质量判断引入了一个统计学的估算，即Contig N50。大于 Contig N50的重叠群可被入选，进入下一步的组装。 由下至 上的 鸟枪法 测序 - 分别构建 2,10,40, 150 kb DNA文库 这是一种由下而上的测序组装策略。2 kb小片段的两端顺序测序后， 可搭建一系列的重叠群。由2 kb两端顺序组建的重叠群可以通过 10 kb片段两端顺序归并，10 kb两端顺序组建的重叠群可以通过40 kb两端顺序归并，依此类推，逐级而上。最后以BAC克隆收尾， 再根据分子标记锚定到染色体连锁图上。 基因组测序覆盖面 在进行一个具体的基因组测序之前，首先需要考虑测序的 规模，即需要获得多少测序数据才能覆盖整个基因组。 这里有一个可供测算的公式用以计算测序的覆盖面，其 中P定义为丢失概率：  P0 = em ，m为覆盖面，即单倍体基因组数；e为自然对 数底数。  若m = 1 P0 = e1 = 0.37 = 37% （遗漏37% ）  若m = 5 P0 = e5 = 0.0067 = 0.67% （遗漏0.67% ）  若m = 10 P = e10 = 4.5 ×105 = 0 0.000 045 = 0.004 5% （遗漏0.0045% ） 理论上遗漏的比例越少越好，但实际基因组测序必须考 虑成本。通常兼顾准确率和耗费，一般覆盖面在x10 。 随机事件发生概率的估算 假定在一个封闭的箱子 里有10个已按序列1 至10编号的小球，每 次从中取出一个小球 记下其编号，反复10 次。按上述公式计算 ，总共有37%即4个 小球从未拿到。如果 将随机挑取小球的次 数增加到50次，此时 从未拿到的小球约占 0.67%，即所有的小 球都有可能被拿到。 大型基因组图位法测序 - 以BAC克隆重叠群 为基础测序 克 隆 重 叠 群 测 序 与 组 装 测序深度（Deepth in DNA sequencing 测序深度与 ）系指测序的DNA核苷酸序列的总 深度测序 长与被测序DNA序列之间的倍数， 即覆盖面积或者平均每个核苷酸被 测序次数。通常基因组测序的总长 要大大超过基因组实际的碱基数目 ，即单个核苷酸被重复多次测序。 一般深度测序指测序覆盖倍数大于7x