18-第8章 转录物组-miRNA.ppt

第8章 小RNA 发现RNA干扰 - 1) 植物转基因沉默 2) 线虫RNA注射实验 3) 线虫发育突变研究 植物转基因沉默 1989年Matzke等将控制紫色花的基因导入矮牵牛细胞, 获得再生植株。由 于 导入矮牵牛的转基因含有反向尾--尾重复的结构，产生正义和反义基因 转录产物，基因转录产物形成dsRNA, 导致转基因和内源基因的沉默,使原 本产生紫色花色的花瓣变成白色. 这是首次双链RNA导致基因沉默. 称之 为转录后基因沉默 (PTGS)。 Dr. Marjori Matzke Dr. Antonius Matzke 线虫双链RNA分子导致基因沉默 1995年Cornell大学的研究人员Guo和Kemphues在研究阻断秀丽新小杆线虫中par-1基因时，发现反义RNA 和正义RNA都可阻断par-1 基因表达, 作者对此未给出合理解释。 Cell 81: 611–620，1995 1998年2月Fire和Mello证实，Guo等报道的结果源于微量RNA双链污染所致。纯化的双链RNA阻断靶基因的表达效率高于单链反义RNA约2个数量级。 Fire等对dsRNA调控内源基因表达称之为: RNA interference, 简称RNAi, 即RNA 干扰. Nature 391:806–11，1998 mex-3 RNA干扰对内源mRNA水平的影响 Fire等，Nature 391: 806–11，1998 RNA干扰实验： a)负对照线虫胚 胎，未注射RNA ,无探针杂交。 b)未注射线虫胚 胎，探针杂交， 显示强杂交信 号内源mRNA。 c)单链反义RNA注 射线虫胚胎， 弱杂交信号。 d)纯化双链反义 RNA注射线虫 胚胎，内源目 标RNA完全降解。 线虫突变体研究发现microRNA 线虫发育 1）秀丽线虫是模 式生物。雌虫 含959个体细 胞，雄性成虫 只有1031个体 细胞。 2）线虫从一个受 精卵发育到成 虫需经历阶4个 幼虫阶段和一 个成虫阶段， 受基因调控。 线虫发育突变与小分子RNA 1988年夏Abros小组克隆影响线虫幼虫发育lin-4基因， lin-4基因突变阻止线虫从L1期进入L2期。他们 发现lin-4可能转录非编码RNA。 Cell 57: 49-57，1989 1993年Ruvkun实验室克隆到线虫突变基因lin-14 ， lin-14突变使L4期线虫多蜕一次皮。lin-14基因3’ 末端与lin-4基因3’末端有互补序列。 Cell 75:843-54，1993 2000年Ruvku G等采用定位克隆分离到let-7基因。 let-7基因编码小RNA，可使lin-41基因沉默，使幼虫过早进入成虫期。 这些小RNA现在被称为microRNA，即miRNA。Nature 403:901-905，2000 lin-4 和let-7RNA发育调控 线虫的发育受时序调控基因控制： L1末期：lin-4表达上调，lin-14 mRNA水平降低，幼虫进 入L2 期。 L3/L4期：let-7表达上调使lin-41 mRNA水平降低，幼虫进 入成虫期。 Lin-14，Lin28, Lin-41和Lin-29，编码蛋白质基因。 Lin-4，Let-7，编码干扰RNA基因。 lin-4 miRNA和let-7 miRNA干扰靶mRMA lin-4和let-7与靶mRNA之间有多种互作方式. Nature 403:901-905, 2000 let-7 miRNA打靶基因lin-14 mRNA lin-4和let-7基因的转录产物为RNA，在细胞中可形成茎环结构，并加工成22 nt 双链小RNA。上图显示let-7转录产物与被调控的lin-14基因3’-端的7个重复序列互补。 Cell, 1993, 75:843-54 microRNA的命名 1）Ambros实验室利用分子杂交发现在线虫不同龄 期幼虫，存在两种大小的小RNA：22-nt和65- nt， 22-nt是功能小RNA终产物。 2）Bartel实验室在线虫，果蝇和人体细胞中发现 存在许多类似lin-4和let-7的保守的小RNA。 Ambros实验室以及Bartel实验室分别对上述长度为21-24 nt，具有干扰靶基因表达的小RNA取名为microRNA。Science 294：862