主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验第十七章流式细胞仪分析技术及应用.pdfVIP

第十七章 流式细胞仪分析技术及应用 第一节 概述 流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成， 可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析，带分选系统的流式细胞仪还可 按实验设计要求分选出具相同特征的同类型细胞，用于培养或进一步研究。 一、工作原理 流式细胞仪的工作原理是采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染 料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中 单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析的精确性。 （一）基本组成结构 1. 液流系统 由样本和鞘液组成。 待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体 压力下进入流动室形成样本流。 鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中 心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。 2. 光学系统 （1）激光光源 （2 ）分光镜 （3）光束成形器 （4 ）透镜组 （5）滤片 （6）光电倍增管（ PMT） 3. 数据处理系统 主要由计算机及其软件组成，进行实验数据的分析、存储、显示，是流式细胞仪组成部件中的重要环 节。 （二）基本工作原理 检测需要标记了特异性荧光染料的单细胞悬液和鞘液，光电倍增管将已接收的光电信号转换成电压脉 冲和积分脉冲，使信号放大，该信号进入计算机系统进行数据转换、储存、分析、处理按不同的检测设计 采用相应软件程序对结果进行综合分析，并以图像和数据显示于荧光屏上，包括了单参数和二维或三维图 像资料，阳性细胞百分率、斜率、峰值、峰面积等多参数资料。 二、散射光的测定 （一）前向散射光 （二）侧向散射光 三、荧光测量 （一）荧光信号测量与放大器 （二）荧光补偿 1 / 4 四、细胞分选原理 （一）分选的基本原理 当实验设计中设定了被分选细胞的特性参数时，此类细胞在形成液滴时会被充电，使其带有正电荷或 负电荷，未被设定分选参数的细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电极偏转板的高压静电场时， 依所带电荷是正或是负而发生向右或向左偏转，落入指定的收集器中，完成细胞分选的目的。 （二）分选的技术要求 1. 分选速度 一般要求分选速度至少达 5000 个／秒左右。 2. 分选纯度 3. 分选收获率 4. 分选得率 第二节 数据的显示与分析 流式细胞仪收集细胞产生的各种电讯号，最终以数字及图式形式表示。每种讯号（除外前向散射光信 号）都包括峰值脉冲信号和面积脉冲信号两种。峰值脉冲信号指的是脉冲的高度；面积脉冲信号指的是电 压脉冲曲线内区域的大小。 一、参数 流式细胞仪的数据参数是指仪器采集的用于分析的信号，包括： 1. 前向散射光（ FS） 反映颗粒的大小。 2. 侧向散射光（ SS） 反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度。 3. 荧光（ FL） 反映颗粒被染上荧光部分数量的多少。 （二）双参数散点图 1. 点图 由两维参数构成，利用颗粒密度反映同样荧光强度的颗粒数量的多少。 2. 二维等高图 二维等高图用等高线来表示细胞数量。一条等高线连接相同细胞数的点，不同的等高线代表不同的细 胞数量，越往里面的线上的点代表的细胞数越多，等高线越密集，细胞数变化越快。等高线选择通常采用 等间距等高线或对数等高线。 3. 假三维等高图 是计算机软件在二维等高图基础上作出的三维立体图；由于图中的一维不是参数，而是细胞数，因而 称为假三维等高图。 （三）三参数散点图 散点图的三维坐标均为参数（散射光或荧光）而非细胞数。 （四）流式细胞仪的多参数分析 三、设门分析技术 流式