非伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157、阪崎肠杆菌和志贺氏菌PFGE操作程序.docxVIP

非伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157、阪崎肠杆菌和志贺氏菌PFGE操作程序分子量标准Braenderup沙门氏菌H9812的操作程序参照本方法。 分子量标准Braenderup沙门氏菌H9812的操作程序参照本方法。 生物安全：根据相关要求，处理所有被污染的塑料制品、玻璃制品、移液管、刀片等。 第0天 菌株接种 挑取新鲜单个菌落，划线接种血琼脂平板，37 ℃过夜培养14 h～18 h。 第1天 plug的制备 打开恒温振荡水浴器（54 ℃），恒温水浴锅（55 ℃～60 ℃），准备比浊计。 制备TE 缓冲液。 注意：TE缓冲液用于制备plug琼脂糖、洗涤裂解后的plug。 制备1% SeaKem Gold：1% SDS琼脂糖，以备制作PFGE plug。 将20%的SDS置于55 ℃～60 ℃水浴中温浴。 称取0.25 g SeaKem Gold（SKG）琼脂糖，加入100 mL锥形瓶。 加入23.5 mL TE缓冲液，轻轻振荡，使琼脂糖充分扩散。 盖上盖子（切勿太紧），微波加热30s，轻轻混合，每隔5 s～10 s重复一次，直到琼脂糖完全溶解。加入SDS之前，锥形瓶置于55 ℃～60 ℃水浴中放置至少5 min。 加入1.25 mL的20% SDS（预热至55 ℃～60 ℃），混合均匀，55 ℃～60 ℃水浴放置备用。 在比浊管上标记相应的菌株编号。 制备细胞悬浮液（CSB）。 分别在标记的比浊管中加入约2 mL～3 mL的CSB，使用无菌棉签从琼脂平板上刮取适量细菌，均匀悬浮于CSB中。 调节菌悬液浓度： bioMérieux Vitek比浊计：透光度≈14%～15%（Falcon 2054管）； 或，分光光度计：610 nm，吸光度1.35（范围1.3～1.4）； 或，Dade Microscan浊度计：0.48～0.52（Falcon 2054管） 0.68～0.72（Falcon 2057管）。 取200 μL调节好的菌悬液加入相应的1.5 mL微量离心管中。如果菌悬液处于室温，可直接加入琼脂糖；如果菌悬液温度较低，应置于37 ℃水浴中温育5 min。 每个微量离心管加入10 μL的蛋白酶K（浓度为20 mg/mL），用枪头轻轻混匀。 注意：蛋白酶K要置于冰/冰盒里。使用前适量融化，实验结束后，丢弃所有融化的蛋白酶K。 每管中再加入200 μL溶化的1% SKG:1% SDS琼脂糖；用枪头轻轻混匀。 注意： 混匀过程中，应避免气泡的产生。 使用过程中，溶化的1%SKG：1%SDS琼脂糖置于55 ℃～60 ℃水浴中，以防止凝固。 立即将上述混合物加入plug模具，室温凝固10 min～15 min，或4 ℃放置5 min。 注意： 混合物加入模具时应避免产生气泡。 使用一次性制胶模具，可制作3个～4个plug。 如果选择可重复使用的plug模具时，需要用400 μL菌悬液、20 μL蛋白酶K（浓度为20 mg/mL）、400 μL的1% SKG：1% SDS琼脂糖，可制作2个plug。 细菌的裂解 注意：同一菌株的3个～4个plug可以放在同一个50 mL的管中裂解。 在50 mL的聚丙烯screw-cap管上做好标记。 配制细胞裂解液（CLB）。 按照下表，计算CLB/蛋白酶K缓冲液的体积： 每管需要5 mL的CLB。 每管CLB需要25 μL蛋白酶K（浓度为20 mg/mL）。 把需要的CLB和蛋白酶K加入适当的容器中，混匀。 菌株数量 CLB 蛋白酶 K （20 mg/mL） 1 5 mL 25 μL 13 65 mL 325 μL 15 75 mL 375 μL 20 100 mL 500 μL 注意：CLB中蛋白酶K溶液的终浓度是0.1 mg/mL，与加入到菌悬液中的浓度（0.5 mg/mL）不同。 每个50 mL的管中加入5 mL的CLB/蛋白酶K缓冲液。 如果需要，用刀片削去模具顶部多余的胶。 一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将plug移入相应的screw-cap管中。 可重复使用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将plug移入相应的screw-cap管中。 注意： 保证plug在液面下，切勿贴在管壁上。 碎胶、胶带、模具、小铲或刀片等（被污染的）应进行适当的灭菌处理。 在54 ℃的恒温振荡水浴器中温育1.5 h～2 h，转速170 r/min左右。保证水面高于管中裂解液的液面。 50 ℃水浴预热足量的无菌超纯水和TE缓冲液。 plug的清洗 将恒温振荡水浴器温度调至50 ℃。 从恒温振荡水浴器中拿出screw-cap管，盖上Green Screened Caps，倒掉CLB。 注意：将管倒置在吸水纸上，尽量排干管内液体。以下操作与此相同。 每管中加入预热至50 ℃的无菌超纯水10 mL～15 mL，