酶工程复习教学PPT课件.ppt

重点 结合水的分类，对酶非水相催化的影响 非水相体系较水相催化体系所具有的优势 非水相催化的特性 蛋白质浓度测定： 染料法 酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 改良Lowry法 蛋白质分子中所含肽键在碱性条件下与铜络合生成复合物产生紫红色化合物（双缩脲反应），同时使肽链展开，蛋白质中半胱氨酸、络氨酸、色氨酸和组氨酸均能使钨酸、钼酸同时失去1个，2个或者3个氧原子，还原成多种还原型的混合酸，并且有特殊的蓝颜色（最大吸收峰波长为745～750nm,）其蓝色深浅与蛋白质含量在一定范围内成正比，由此可测出样品中蛋白质的含量。同时蛋白质肽键发生烯醇化反应能使钼离子在pH10时螯合在肽结构中，形成复合物，从而使电子转移到混合酸的显色剂上，大大增加了酚试剂对蛋白质的敏感性。 双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2， —C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1～10mg蛋白质。 紫外吸收法 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 BCA法测定蛋白质浓度 二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的BCA　Solution　A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。 糖化酶的测定方法有次碘酸钠法、SP法、DU法、NPG法、DNS法 次碘酸钠法： 碘与NaOH作用能生成NaIO，在酸性条件下能够氧化葡萄糖，未参与反应的NaIO可以转变为I2析出，用Na2S2O3标准溶液滴定析出的I2，便可推导出经糖化酶催化所生成的葡萄糖的含量。 SP法（蓝一爱农法）：样品除去蛋白质后，在加热条件下，直接滴定标定过的碱性酒石酸铜溶液，以次甲蓝作指示剂，使样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由蓝色变为无色，即为滴定终点。根据样液消耗量可计算出还原糖含量。 DU法：美国 Miles 公司采用 Schoorl 法， 即以 4%淀粉为底物， pH4.2、 于 60℃反应 1h， 用 Schoorl 法测定所生成葡萄糖的量， 1h 生成 1g 还原 以 糖的酶量定义为 1 个糖化酶活力单位 （DU）。 NPG法（对硝基苯酚葡萄糖）：α-葡萄糖苷酶活力测定是采用对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作反应底物；该底物是无色的。经α-葡萄糖苷酶水解α-1，4-葡萄糖苷键后可以释放出对—硝基苯酚(pNP)，在碱性条件下是黄色的，因此可以通过测定410nm处的吸光度增加值计算酶活力。 DNS法：利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。 RNA聚合酶 催化转录的RNA聚合酶是一种由多个蛋白亚基组成的复合酶。如大肠杆菌的 RNA聚合酶有五个亚基组成，含有α，β，β’，σ等4种不同的多肽，其中α为两个分子，所以全酶（holoenzyme）的组成是α2ββ’σ。σ亚基与RNA聚合酶的四聚体核心（α2ββ’）的形成有关；只与RNA转录的起始有关，与链的延伸没有关系，一旦转录开始，σ因子就被释放，而链的延伸则由四聚体核心酶（core enzyme）催化。所以，σ因子的作用就是识别转录的起始位置，并使RNA聚合酶结合在启动子部位。 细菌的RNA聚合酶由5种不同的多肽链构成，按分子量大小排列分别为β，β，σ，α和ω。每分子RNA聚合酶除有两个α亚基外，其余亚基均只有一个，故全酶为ββα2σω * 表1-1 酶工程 ——总复习