植物细胞悬浮培养长期保存的简单而有效的方法.doc

植物细胞悬浮培养长期保存的简单而有效的方法 Anne-Marie Boisson, Elisabeth Gout, Richard Bligny* and Corinne Rivasseau* 摘耍背景：植物细胞悬浮液每周反复的传代培养需耍大量的劳力, 并且增加子代细胞的变异率。大多数的细胞保藏规程是基于冷冻和解冻的 控制，存储在液氮中。然而，细胞解冻后的存活率是不确定的。植物细胞 培养的长期存储和再生依然是一个重点。 结果：美国梧桐(Acer pseudoplatanus)和拟南芥细胞在不含磷酸盐 的营养培养基上悬浮培养，5°C下细胞保存时间超过6个月。通过数小时 测量气体交换监测 31细胞活力的恢复和利用细胞体内外13C P代谢的核磁共振分析， 表明细胞生长 的重启并没冇明显的延迟，也没冇观察到可测量的细胞死亡。 结论：我们提供了一个保护生理上同源的植物细胞培养的简单方法, 而不需要通过数月的传代培养。基于细胞生长的阻碍和培养温度低的这个 方案对于异养和半自养的细胞是有效的。并且应该用来改善这项研究外的 细胞株。它不需要专门的设备，适合常规实验室使用。 关键词：植物细胞悬浮液 美国梧桐 拟南芥 细胞保藏 体内和体 外的核磁共振光谱低温磷饥饿 背景 孤立的植物细胞悬浮培养是极具价值的方法，为高通量的研究提供素 材，如代谢分析、二级植物产品的生产和除草剂的发现。它使在细胞生理 和生化同源性整体上的实验变得容易。在液体营养培养基（NM）上大量 培养植物细胞的各种不同方法己经被描述了的很长时间[1?4] o这种方法 是基于当大部分最初添加到营养培养基的营养物质，特别是碳水化合物, 代谢完时细胞悬液的传代培养己经达到稳定状态。这将导致或多或少的同 源细胞群体，并且常诱导一个继传代培养之后的生长延迟（滞后期）[5]o 这显示为获得同源细胞悬浮培养需要一些精密仪器，如用来优化营养培养 基和进行细胞培养的恒化器⑹。另外，每传代培养 一天或者两天同样可以获得同源细胞群[7]。但涉及很多处理和维护, 因此很难执行很长一段时间。 为此，理想上无限周期的用于保存最近优化的细胞悬浮培养的交替法 被提出。除了维护导致明显延迟启动同源细胞悬浮培养的在固体培养基上 的愈伤组织Z外，大多数的做法是基于冷冻和解冻的控制，存储在液氮屮 [8-12] o然而，编者常提及的是在细胞培养生长完全恢复之前解冻后的细胞 生长能力通常底下并处于较长的停滞阶段。最高的生活能力（高达90%） 由门杰斯和莫里观察到[13],是经过低温贮藏在二甲基亚飒和山梨醇的拟 南芥和烟草细胞。不过，即使在这种情况下，至少需要一个星期解冻后的 细胞才能恢复正常生长和完全重建，并且存在保藏的细胞系可能与最初的 细胞相异的风险[14] o 这里，我们描述一个方案，旨在经过几个月的悬浮培养Z后维持更高 的植物细胞总数，保持细胞同源性，并准备好在恢复到标准培养条件后细 胞重新生长。主要问题是在标准培养基上碳源少于两个星期即被消耗完, 随后观察到自体吞噬程序和细胞死^[15,16]o为了减少细胞的碳源消耗量, 第一个一系列分析实验中细胞培养将在低温下进行。培养将在低温并缺磷 情况下进行，目的在于诱导遏制细胞生长[17]o为使方案有效，通过同时 测量细胞生长和气体交换监测细胞的生理和生化状况，并利用细胞体内外 13C 31P代谢的核磁共振图谱分析[18, 20]。核磁共振检测可使探侦测与 碳丢失[21]所导致自体吞噬相关基因表达的有关新陈代谢瓦解的早期信号 [22] o利用异养的美国梧桐细胞（Acer pseudoplatanus L.）和半自养的拟南芥 细胞（Arabidopsis thaliana L,野生型，哥伦比亚生态型）培养所获得的结 果与形成形成层的不含叶绿素的细胞和形成叶组织的发光的叶绿素细胞 培养的结果进行比较。据估计，由于光合作用的进行，细胞对外界的糖类 物质的需求减少，因此可以减少对营养培养基的更新。 结果与讨论 22°C和5°C下美国梧桐和拟南芥悬浮培养的细胞生长量 在22°C下，美国梧桐每周传代培养的细胞鲜重（FW）随吋间以指数 增长而没耍迟滞期（⑺和图X）。稳定期在培养2个星期后开始，相应的 细胞鲜重为150±15gl-lo如果细胞在这个阶段进行传代培养，归因于蔗 糖供应的消耗和有关 的自体吞噬程序的开始的一个2天迟滞期被观察到。在5°C下，细胞 倍增吋间非常长为10天，而在22°C下为2.527天（图lb）。冇趣的是， 营养培养基的PH由最初校准的5.7逐渐增大到7.1-7.3 o这可能是由于在 Lamport营养培养基上硝酸盐作为唯一碳源存在和在22°CPH尽管低于6.5, 酸化的C02释放的更低。 在22°C下，拟南芥细胞在光能混合营养型条件下培养的生长量显示一 个相似的特