医学生物化学基础及技术 6.亲和层析 项目四6.亲和层析-操作方法.ppt

* 聊城职业技术学院 王辅明 医学生物化学基础及技术 职业教育医学生物技术专业教学资源库 亲和层析的操作方法 一、基质的选择 理想的基质应符合下面的要求: 1.极低的非特异性吸附； 2.高度的亲水性； 3.较好的理化稳定性； 4.大量的化学基团能被有效地活化,而且容易和配体结合； 5.适当的多孔性； 一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联萄聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。 sepharose4B具有层析速度较快,化学稳定性好,非特异吸附少,微球孔径适度蛋白載量大的特点,并且有大量可供活化的羟基,是亲合层析的理想介质。 二、配体的选择 理想的配体应具有以下一些性质: 1.配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造成洗脱的困难。总之，配体和待分离物质的亲和力过弱或过强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待分离物质具有适当的亲和力的配体。 2.配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，也就是说配体与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸附作用。这是保证亲和层析具有高分辨率的重要因素。 二、配体的选择 3.配体要能够与基质稳定的共价结合,在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明显影响。 4.配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的较剧烈的条件，可以多次重复使用。 二、配体的选择 根据配体对待分离物质的亲和性的不同,可以将其分为两类:特异性配体(specific ligand)和通用性配体(general ligand)。 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素一受体等,它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。 二、配体的选择 通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素(lectine)可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。 三、亲和吸附剂的制备 1.活化 基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。 (1)溴化腈活化法 溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应，主要生成异脲衍生物。反应如下: 三、亲和吸附剂的制备 这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa=10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，増大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。 三、亲和吸附剂的制备 (2)环氧基活化法 在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。 三、亲和吸附剂的制备 这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的N-C、O-C和S-C健都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH为9-13，温度为20-40℃。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。 上面两种方法是比较常用的方法。另外还有甲苯磺酰氯法、双功能试剂法。 三、亲和吸附剂的制备 2.偶联 经过活化和洗涤过的基质与等体积的0.2-0.5m01/L碳酸盐缓冲液混合，缓慢搅拌2小时，或室温下过夜，以便配体和基质充分偶联而形成固体载体。对于偶联极牢固会丧失活性的大分子物质配体，则应在低pH值缓冲液中反应或活化基质预先在pH8.3的碱性溶液中进行适当的水解作用，这样可提高配体的活性。 配体和基质偶联完毕后，必须要反复洗涤，以去除未偶联