DNA文库的构建精.ppt

4 、双链 cDNA 的分级分离 连接前回收大于 500bp 的 cDNA 用于连接。去掉 引物、街头及反转录产生的各种不完整的 cDNA 链， 提高文库质量。 ? 5 、双链 cDNA 与载体连接 1 ）同聚物加尾： 2 ）加接头引入酶切位点， 添加带有限制性酶切位点的 接头是最常用的方法 3 ） cDNA 的定向插入： cDNA 两端添加不同的 限制性酶 切位点，双酶切后与对应的双酶切载体连接 同聚物加尾法： 末端转移酶 +dCTP 末端转移酶 +dGTP 载体和 cDNA 退火 加接头 CH3 CH3 CH3 接头 CH3 CH3 CH3 cDNA 的定向插入 ds-DNA合成 与SalI匹配 接头相连 NotI酶切 载体 1)SalI/NotI 2)T4 DNA ligase NotI primer/adaptor SalI adaptor cDNA重组子 6 、 cDNA 文库的载体选择 一般 cDNA 的长度范围多在 0.5-8kb 之间， 因此不用考虑外源片段的长度。 质粒载体或噬菌体载体 7 、 cDNA 文库的均一化处理 均一化 cDNA 文库： 是指某一特定组织或细胞的 所有 表达基因 均包含其中，且在 cDNA 文库中表 达基因对应的 cDNA 的 拷贝数相等或接近 。 均一化 cDNA 文库是 克服 由于基因转录水平 上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措 施，有利于研究基因的表达和序列分析。 构建均一化 cDNA 文库主要有两种途径： 基因组 DNA 饱和杂交法 基于复性动力学原理的均一化学法 基因组 DNA 饱和杂交法 ? 理论基础：不同表达水平的基因对应的基因组拷 贝数相对一致。 步骤： 1 ）基因组 DNA 的酶切、固定 2 ）基因组 DNA 变性成单链 3 ）分离纯化 cDNA 文库的混合质粒 4 ）文库 DNA 与固定的基因组 DNA 充分饱和杂交，固 定相应的 cDNA, 5) 洗脱 cDNA 并重新转化受体菌。 ? 限制：由于基因组的复杂性，很难获得覆盖基因组的 单链 DNA 片段，导致文库内基因的丢失。 基于复性动力学原理的均一化方法 理论基础：复性动力学原理 cDNA 文库中高丰度 cDNA 复性所需时间较短，低丰度 cDNA 复性所需时间较长，通过控制复性时间可使高丰 度的 cDNA 复性成双链状态，而低丰度 cDNA 仍保持单 链状态，分离单链 cDNA ，转化宿主细胞，即可得到均 一化 cDNA 文库。 四、基因克隆的筛选策略 1 、表型筛选： 在宿主菌中表达目的基因，使宿主产生新的 表型或使宿主恢复其突变基因的表型来筛选目的 基因。 (1) 抗药性筛选 : 这是利用载体 DNA 分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。 (2) 插入失活筛选法 (3) 显色反应选择法 (α - 互补法 ) 将含有 β - 半乳糖苷酶基因（ LacZ ）的调控序列和 氨基端（ N 端） 146 个氨基酸编码序列的质粒转化 至可编码 β - 半乳糖苷酶羧基端（ C 端）部分序列的 宿主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，融 为一体，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的 宿主菌在含有 IPTG/X-gal( 异丙基 - β -D- 硫代半乳糖 苷 /5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 - β -D- 硫代半乳糖苷 ) 的培养基 上产生蓝色菌落，这种现象就称为 α - 互补。 第八章 DNA 文库的构建 教学目的 掌握：基因组文库构建的基本原理和步骤、 cDNA 文库构建的基本原理和操作技术； 熟悉： cDNA 第一链的合成、 cDNA 第二链的合 成； 一、基因文库 某一生物全部基因的集合 叫该生物的基因文库。 某一生物部分基因的集合叫 该生物的亚基因组文库。 基因文库（ gene library) ： 某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载 体在 体外重组 后， 转化宿主细胞 ，并通过一定的选择 机制筛选后得到大量的 阳性菌落 （或噬菌体），所有 菌落或噬菌体的 集合 即为该生物的基因文库。 外源 DNA 片断、载体、宿主 构建基因文库的基本程序： （ 1 ）提取研究对象基因组 D