第8章受体的放射配体结合分析技术.ppt

2021/2/21 * 放射性配基结合法的应用和前景 （1）阐明药物和激素递质的作用机制 受体研究可对药物、激素、细胞因子、递质的作用深入到生物大分子之间的相互作用,涉及到细胞功能的触发阶段信号传导的机制。这是生物之间协调生命活动最初的信号传导过程。 （2）探讨疾病的病因和发病机理 研究证实胰岛素受体性能和数量不正常,可能同糖尿病、肥胖病有密切关系,另有些疾病由于受体合成受阻、更新率受限制以及产生了受体蛋白的自身免疫抗体等,阻止了受体各配基的相互结合,因而产生疾病。 2021/2/21 * （3）新药设计和药物筛选 利用放射配基结合分析法筛选药物,简单、快速、结果可靠、所需样品量少。观察到某一药物对某一受体有亲和力将表明该药可能具有药理作用;如对多种受体或亚型都有一定亲和力,则表明药物专一性不高,可能出现副作用。 此法缺点是不能反映药代动力学和药物到达受体部位等一系列生理生化过程。亲和力试验也不能完全鉴别激动剂和拮抗剂。因此,受体结合分析应该伴随动物和生物鉴定等工作。 2021/2/21 * （4）测定组织或血液中药物的浓度 放射配基结合法可定量地测定生物样品中内源性物质和药物浓度。先作一已知不同浓度药物抑制放射配基与受体特异性结合的标准曲线,然后测定未知样品（组织或血样提取物）抑制该放射配基与受体特异性结合的百分率,从标准曲线即可查出未知样品中所含药物的量。 该法具有特异性强、灵敏度高和快速简便等特点。 2021/2/21 * 上,并可在一般同位素实验室内合成; 缺点: 配基必须含有芳香族羟基,如酪氨酸残基,在配基分子中,参入一个碘原子一般不会影响它的生物活性,但参入二个以上的碘原子时,会降低配基的生物活性。此外,在标碘过程中,也可引起配基分子的改变。碘化的配基与原来的配基不完全相同,且不易纯化。另外,125I标记物的半衰期只有二个月。 2021/2/21 * ②检测标记配基的放射性纯度。 常规结合实验只有大约10%的标记配基与组织受体结合,因此放化纯度应在90%以上。最常用的纯度检查是薄层层析,有时也可用核磁共振检查配基分子结构的细微改变。经过纯化后的样品,在使用前还应该作放射性浓度测定。 2021/2/21 * ③样品的贮存。样品应放在密封避光瓶中,必要时加入抗氧化剂低温保存。 ④监测标记配基是否变质。 在结合实验中,最好先检查标记配基是否发生改变。其办法是将配基与相应的膜受体制剂温育,在反应终止时,抽提结合在组织受体上的放射性物质,用TLC法分析纯度,其Rf值在保存期间应该保持一致。 2021/2/21 * （2）受体组织 建立受体结合实验时, 首先,应该充分考虑选用合适的生物组织,该组织应含有对特定配基有生物学反应的受体。 在一定条件下,受体的结合量与受体组织浓度呈线性关系。就多数配基来说,专一结合与受体的浓度呈直线关系。随着受体组织浓度的继续增加,专一结合出现下降趋势,表明温育时,标记配基有被组织分解的可能性,或者是组织内存在着内源性配基。 2021/2/21 * 这种内源性配基对标记配基,起着干扰作用。就很多受体来说,另一个可能性是标记配基的亲和力的下降等于或超过结合部位数目的增加,这时组织量结合效应曲线可能向下曲折。为了得到更精确并可重复的结合数据,正式实验应该选用线性范围内的组织浓度。 2021/2/21 * 其次,还应该确定专一结合是否限于已知含有这些受体的组织或器官。 例如,所研究的受体,已知只存在于中枢神经系统,则专一结合就不应该在其他器官,如肺、肾、心、肠等内出现。 2021/2/21 * 受体制剂的制备方法很重要。 多数神经递质的受体结合实验,采用洗过的脑组织匀浆。 一般先用匀浆器或超声波粉碎器,以50~100倍容积的的非等渗缓冲液或蒸馏水将脑制成匀浆,然后离心,将沉淀物捣碎,再用上述溶液洗涤一次以上,除去可能存在的内源性物质,以避免对专一受体干扰。 2021/2/21 * （3）温育条件 ① 缓冲液。 对神经递质受体结合实验最适宜的缓冲液是经过反复实验后确定的,包括最适宜的浓度与pH。 常用的无机缓冲液是Na+-K+磷酸溶液,有机缓冲液是Tris溶液。 为了研究离子对受体结合过程的影响,可以采用不含无机离子的缓冲液。如钠离子可以改变阿片受体的反应性,降低受体与激动剂的亲和力,但不改变拮抗剂的作用强度。同样,硫氰酸盐和碘盐,可增加拮抗抑制脑受体结合3H-GABA的强度,但不影响激动剂的活性。 2021/2/21 * 几乎所有受体结合实验的最适pH都在7~8,除总结合外,结合部位的专一性也随