结构生物学：第一讲-2 结构生物学概论.ppt

第四节 结构生物学的研究方法 结构生物学实验研究手段中除了经典的研究生物大分子结构的主要三大手段： (4.1) X-射线晶体学； (4.2) 电子晶体学； (4.3) 多维核磁共振； (4.4) 扫描隧道显微镜； (4.5) 以及各种谱学技术； 理论研究手段则以计算机分子图形学及量子力学等为主。 (4.1) X-射线晶体学 x-射线晶体学这样一个最初专门用来测定无机或有机小分子化合物结构的物理学工具的确为结构生物学研究帮了大忙。 自1912年劳厄（Laue）发现晶体对X-射线衍射，就预示X-射线晶体学时代的到来。 最初在1913年布拉格(w．L．Bragg)测定了氯化钠和金刚石的晶体结构，从此，x-射线晶体结构分析就成为测定晶体和分子结构的主要方法。 在早期，著名的霍奇金(D．Hodgkin)教授应用这个方法测定了胆固醇、维生素D、青霉素和维生素B12的结构，以后随着结构生物学的发展，蛋白质 晶体学已逐渐成为一个非常重要的独立分支学科，X-射线晶体学成为一个非常重要的研究手段。 生命科学中的每个重要新发现几乎都伴随着晶体结构的阐明。 虽然其他方法也在飞速发展，但直到1998年4月，从PDB(Protein Data Bank)发布的数据看x-射线晶体结构分析方法所测定的结构仍占81.9％。 可以说100年间x-射线晶体学在物质结构，特别是晶态物质结构的发现上一直占主导地位， 目前它正努力在四维结构变化上，在第三代同步辐射新技术的应用方面使得生物大分子精细结构的研究达到更高的水平。 4．2 电子晶体学及电子显微学三维重构 X-射线晶体学是借助于x射线与晶体的相互作用来研究晶体结构，而电子晶体学则是借助于电子与晶体的相互作用来研究晶体结构的科学。 因为电子与物质的相互作用远强于X-射线，所以电子晶体学适合研究微小晶体与薄膜的结构。 像膜蛋白，由于它一般很难分离纯化，也很难得到单晶，又不溶于水，所以电镜就成为很有希望的研究方法。 另外，X-射线晶体学是从x射线衍射数据来获得晶体的结构信息，电子晶体学则还可以通过磁透镜聚焦，用电子显微成像来获得晶体的结构信息。 De Rosier和Klug两位科学家于1968年提出的电镜三维重构的思想就是用电子显微成像后，再把试样沿不同方向投影，将得到的一系列投影像进行电子显微学三维重构。 这在膜蛋白结构的测定上起了很大的作用。 4.3 多维核磁共振方法 核磁共振(Nuclei Magnet Resonance，NMR)是测定溶液中生物大分子结构、构象及其相互作用并能给出原子分辨水平详细结构信息的最有力的工具之一。 1957年Jardetzky首先用NMR技术研究氨基酸。同年，Saunders 等也发表了关于核糖核酸酯的第一篇NMR论文。 此后，NMR方法不断改进，直至二维和多维核磁共振的诞生使生物大分子的结构测定成为可能。 X-射线衍射确实是测定生物大分子结构的主要方法，但它对于液体和非晶态固体生物样品中生物大分子的结构分析就受到一定限制。 当—个样品的三维结构已确定，要研究它的运动和变化则要依靠NMR技术。 NMR最主要的优势在于它测定的是液体，它所测定的结构可以是处于生理环境下的动态构象群，所以更能反映生物大分子有机体内的实际情况。 NMR技术目前发展很快，用NMR已经可能测定出几万分子量的未知蛋白的结构，像Wuthrich 等人用二维核磁共振测定蛋白完整的空间结构也已经获得成功。 随着NMR一整套新技术的运用，如超导核磁、快速傅里叶变换、三维共振实验等等，NMR已经能在溶液或非晶态中测定生物大分子三维结构及其动力学变化。 另一方面，最近国际上少数先进的NMR实验室也在开展类似于液态分子构象的固体NMR的研究工作，比如在固态下，生物膜的高分辨研究也取得了一些重要进展。 而且NMR方法测定的结构数量也有了迅速的增长，其完整结构测定的分子量上限已突破了35000，预计未来几十年内，NMR方法的测定结果在结构生物学上将会与X-射线衍射晶体学的结果并驾齐驱，互相补充。 从技术需要来看，优秀的国家实验室应在以上三个主要方向并向发展。 4.4 扫描隧道显微术在结构生物学中的应用 第一台扫描隧道显微镜(Scanning Tunneling Microscope，STM)是瑞土的葛·宾尼(Gerel Bining)和海·罗需尔(Heinrich Rohrer)于1982年发明、研制出来的。 它的出现使人类能够实时地观察单个原子在物质表面的排列状态以及与表面电子行为有关的物理化学性质。这两位科学家因此获得诺贝尔物理学奖。 它的原理主要是利用隧道效应，使极细小的一个探针与被研究的物体表面构成两个电极，当它们之间的距离小于1nm时，在外加电场的作用下，电子就会穿过两个电极之间的