胰蛋白酶比活力的测定.ppt

胰蛋白酶比活力的测定 实验原理 胰蛋白酶是一种水解酶，该酶对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其它氨基酸所形成的肽键具有高度专一性。 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 （BAEE） N-苯甲酰-L-精氨酸 （BA） 胰蛋白酶 实验原理 BAEE在253nm的紫外吸收远低于BA，在胰蛋白酶催化BAEE水解生成BA的过程中，反应体系在253nm的紫外吸收值会随之增加，因此可以用ΔA253nm来计算胰蛋白酶的酶活力。 实验原理 胰蛋白酶酶活力单位：在本实验条件下，以 BAEE为底物，每分钟使ΔA253nm增加0.001所 需的酶量定义为1个酶活力单位。 胰蛋白酶比活力：每毫克胰蛋白酶所具有的酶 活力单位数。 主要试剂和实验仪器 底物：2mmol/L BAEE 胰蛋白酶（1mg/ml） 0.05mol/L pH7.8 Tris-HCl 缓冲液 紫外分光光度计 实验操作 1. 取2支试管，分别标号为1（空白组）、2（实验组），按照下表顺序加入各相关试剂。 试剂 空白组/ml 实验组/ml 2mmol/L BAEE 2.80 2.80 0.05mol/L, pH7.8 Tris-HCl 缓冲液 3.00 3.00 去离子水 0.18 —— 待测胰蛋白酶 —— 0.18 总体积 5.98 5.98 2. 实验组中加入胰蛋白酶后立即混匀，在30s内向比色皿中准确加入3ml待测样品，用分光光度计将空白组A253nm校正至0，而后开始记录时间，测定实验组A253nm。 3. 每隔1min读取A253nm值一次，至6min终止读数。 4. 计算每分钟平均A253nm增加值，即ΔA253nm/min，进而计算得出胰蛋白酶活力单位数（U）及胰蛋白酶比活力（U/mg）。 实验操作 ΔA253nm/min = [(A6min-A3min)/3+(A5min-A2min)/3+(A4min-A1min)/3]/3 U = （ ΔA253nm/min ）/0.001 胰蛋白酶活力单位数（U） 胰蛋白酶质量浓度(g/L)×[(3/5.98)×0.18] U/mg =