9人类性染色质小体的制备与观察.ppt

实验9 人类性染色质小体的制备与观察 实验目的 实验原理 实验材料与药品 实验方法 注意事项 实验作业 思考问题 掌握观察与鉴别X染色质的简易方法，识别其形态特征及所在部位，为进一步研究人体染色体的畸变与疾病提供参考依据。 发现 1949年，Barr在雌猫的神经元细胞核中首次发现一种染色较深的浓缩小体，而在雄猫则没有。 进一步研究发现，其他雌性哺乳动物（包括人类）也同样有这种显示性别差异的结构。而且不仅是神经元细胞，在其他细胞的间期核中也可以见到这一结构，称之为巴氏小体，也称为X染色质。 研究发现，间期核内X染色质的数目总是比X染色体的数目少1。 进一步研究表明： X染色质是一条异染色质化（兼性异染色质）的X染色体，在间期复制要比其他的染色体晚。 莱昂假说（1961年，Mary Lyon ） 雌性哺乳动物体细胞内仅有一条X染色体是有活性的。另一条X染色体在遗传上是失活的，在间期细胞核中螺旋化而呈异固缩的X染色质。 X染色体的失活是随机的，也是恒定的。 X染色体失活发生在胚胎早期（妊娠第16天）。在此以前的所有细胞中的X染色体都是有活性的。 人类在受精后的第16天（受精卵分裂到5000-6000），植入子宫壁时发生lyon化。 剂量补偿： 由于雌性细胞中的两个X染色体中的一个发生异固缩（也称Lyon化），失去活性，这样保证了雌雄两性细胞中都只有一条X染色体保持转录活性，使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上。这种效应称为X染色体的剂量补偿。 证据1 莱昂学说的生物化学证据首先来自对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)杂合妇女的皮肤成纤维细胞中G-6-PD表达的研究。 G-6-PD位于X染色体上，其活性在男女中是相同的。G-6-PD有A、B两种类型，二者仅相差一个氨基酸，由一对等位基因GdA和GdB编码。当取自GdA/GdB杂合妇女的皮肤细胞原始培养物时，电泳图谱上出现A、B两种条带，而当检测克隆培养物时，每个克隆只出现一条电泳带，完全表现为A型或B型条带(图)。 证据2—玳瑁猫 三色猫，又叫玳瑁猫。 雌性的三色猫腹部的毛是白色的，背部和头部的皮毛由桔黄色和黑色斑组成。这种雌猫是X-连锁基因杂合体。b基因控制橙色毛皮，其等位基因B是控制黑色的毛皮。 带有b基因的X染体若失活，B基因表达，产生黑色毛斑；若带有B基因的X染色体失活，b基因表达，则产生橙黄色毛斑。 Y染色质 正常男性的间期细胞用荧光染料染色后，在细胞核内可出现一荧光小体，直径为0.3--1μm左右，称为Y染色质。 Y染色质在间期也呈现异固缩状态。Y染色体长臂远端部分为异染色质，可被荧光染料染色后发出荧光。这是男性特有的，女性细胞中不存在。细胞中Y染色质的数目与Y染色体的数目相同。 口腔颊部粘膜细胞 毛囊 60%冰醋酸 45%冰醋酸 卡宝品红 75%乙醇 2．发根细胞巴氏小体观察 拔取带毛囊头发一段→ →→45%冰醋酸解离5min→ →剥取毛囊→ →卡宝品红染色10min→ → →压片观察 将第一次刮下的口腔粘膜上皮细胞用酒精棉球擦去，在原位重复刮一下制片；待涂片略干再加冰醋酸固定 染色时间不要太长，否则核质着色深，X染色质体不易区分； 毛囊细胞要充分解离，压片前可先用解剖针敲片，使细胞解离； 分别观察男女各50个可数细胞，计算显示X染色质所占百分比。 观察中选绘1-2个典型细胞，标明X染色质的形状和部位。 可数细胞的标准：核质染色呈网状或颗粒状；核膜清晰，无缺损；染色适度，周围无杂质。 X染色质 男女个体细胞中的巴氏小体 并非每个细胞都可看到巴氏小体，这与细胞的状态、着色情况有关。 G1期：DNA没有复制，巴氏小体最小。 S期： DNA在进行复制，巴氏小体中等。 G2期：DNA完成复制，巴氏小体最大。 正常女性（46，XX）的口腔粘膜细胞中，X染色质约15%左右，平均16.4%，一般不超过30～35%，仅含1个X染色质。 男性只有0～3%，平均0.7%。 * * ？ 克隆培养时，每个克隆只出现一条电泳带 1．口腔颊部粘膜细胞巴氏小体观察 刮取颊部粘膜上皮细胞（用灭菌玻璃片）→涂片（两片45°角）→60%冰醋酸固定5min→吸去冰醋酸，卡宝品红染色10min→盖片→镜检